非A-E型肝炎の原因ウイルスの同定

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670504
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 田中 栄司 信州大学, 医学部, 助教授 (50163506)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清澤 研道 信州大学, 医学部, 教授 (30020829)
• Keywords: 非A-E型肝炎 / SENウイルス / サブトラクションPCR / クローニング

Research Abstract

本年度は、新しい簡易DNAサブトラクション法の条件設定を行った。最初に、単一プライマーPCR増幅法に用いるプライマーを、testerおよびdriver用の2種類を選定した。コンピューター上でランダムな配列を作成し、PCRプライマー設定用のプログラムを用いて、融解温度が同一で、相互に、また相補的な配列についても交差反応しない2種類のプライマー配列を抽出した。さらに、gene bank上で、既知の遺伝子配列にそのプライマー配列が存在しないことを確認した。次に、既知のウイルスの配列から、普遍的に存在し、かつ断片の長さがPCRにて検出しやすい100〜800merになる制限酵素部位を検索した。先に設定したプライマー配列にこの制限酵素の断端を含むoligomerを加え合成し、相補的なoligomerと組み合わせてadopterを作成した。市販のラムダDNAをコントロールとして用い、制限酵素にて切断し、アダプターをライゲーション後、driverプライマーにて増幅し、予想通りの生成物が得られるようにPCRの条件を設定した。また、HCVのコア領域を組み込んだプラスミドをターゲットとして、ラムダDNAと濃度を変えて混合し、両者のDNA濃度差が縮まるように特殊なPCR条件を設定した。これにより1000倍の濃度差を縮める条件を設定可能であった。サブトラクションの確認では、ラムダDNAとHCVの遺伝子を組み込んだプラスミドの混合物を作成し、これをtesterプライマーにてPCR増幅した(特殊PCR条件)。一方、ラムダDNAを単独で、ビオチン化したdriverプライマーにてPCR増幅した。両者を1:100の割合で混合し、マグネティックビーズを用いてサブトラクションを行い、得られた検体をPCR増幅したところ目的としたHCVの増幅産物が得られた。

Research Products

• [Publications] Tanaka E, Takeda N, Li TC, et al.: "Seroepidemiological study of hepatitis E virus infection in Japan using a newly developed antibody assay"J Gastroenterol. 36. 317-321 (2001)
• [Publications] Umemura T, Alter HJ, Tanaka E, et al.: "SEN virus : response to interferon-α and influence on the severity and treatment response of coexistent hepatitis C"Hepatology. (in press).