糖尿病性ニューロパシーの電気穿孔法を用いた遺伝子治療の確立

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670679
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 村上 龍文 川崎医科大学, 医学部, 助教授 (30330591)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大澤 裕 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80246511) ; 砂田 芳秀 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00240713)
• Keywords: 糖尿病性ニューロパシー / 電気穿孔法 / 遺伝子治療 / VEGF

Research Abstract

1.VEGF_<164>発現ベクターの作成
マウスの筋mRNAよりRT-PCRで26アミノ酸のシグナルペプチドを有するマウスVEGF_<164>cDNAを作成したcDNAシークエンでは発表されている塩基配列と比較すると3つのnonsense変異と2つのアミノ酸置換を伴う変異が見い出された。次にこのマウスVEGF_<164>cDNAを真核細胞発現ベクターで筋肉でも強力に発現するサイトメガロウイルスプロモーターを持つpCAGに組み込みこんだ。さらにこのベクター(pCAG-mV3)を培養細胞であるCOS7にトランスフェクションしwestern blotを施行し、還元型と非還元型のVEGFの発現を確認した。
2.電気穿孔法でのマウス骨格筋へのVEGF_<164>発現ベクター導入
電気穿孔法遺伝子導入装置CUY21を用い以前他の装置で見い出した筋肉での至適条件で(1μg/μlの濃度で50μg筋注、2本の平行針電極を前脛骨筋に刺入、電気刺激装置で75V/5mm,50ms,3pulse,電位を替えもう3pulse刺激)、C57Bl/6マウス前脛骨筋にpCAG-lacZを導入しβ-galactosidase発現を確認した。以上の条件で正常C57Bl/6にpCAG-mV3を導入し、現在VEGFの発現をwestern blot法で確認中である。
また当初予定していたdb/dbマウスに替わり、より匹数を揃えることが容易なストレプトゾトシンを腹腔に投与し糖尿病を発症させたC57Bl/6を糖尿病性ニューロパシーモデルマウスとして準備中である。