辺縁帯形成におけるcystatin A架橋メカニズムとその役割

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670860
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 高橋 英俊 旭川医科大学, 医学部, 講師 (00216748)
• Keywords: cystatin A / 辺縁帯 / 架橋 / 遺伝子調節 / MAPK / ERK / JNK / 皮膚

Research Abstract

1)現在我々が保有しているhuman cystatin A cDNAをGST遺伝子の下流につないだ大腸菌発現ベクターを作製し、合成蛋白を作製した。western blot法によりcystatin Aが発現されていることを確認後、GSTカラムおよびトロンビンにて合成cystatin Aを生成した。
次に、合成cystatin A蛋白をトタンスグルタミネース(宝酒造より購入)によりin vitroで反応、反応産物をSDSベージにより検討したところ2から4merのcystatin A産物の形成を認め、cystatin Aがトタンスグルタミネースにより架橋させる確認された。現在、3H-プトレシンと生成cystatin Aを架橋させ、この架橋物をトリプシン処理しHPLCにて分画、架橋部位を同定中である。
2)cystatin Aが実際に辺縁帯に架橋されていることを確認するため、免疫電顕にて検討したところ同じ辺縁帯構成成分のひとつであるinvolucrinと同様に辺縁帯内面に架橋されていることを確認した。
3)cystatin Aの遺伝子調節機構を検討するため、cystatin A遺伝子プロモーター領域をCAT遺伝子につないだレポーターベクターと各種MAPK発現ベクターを正常角化細胞に導入し、プロモーター活性を検討した。dominant negative ERK、MEK1、raf-1を導入するとその活性は上昇した。一方、dominant negative JNKを導入すると逆に抑制された。この現象はアデノウイルスベクターを用いて、蛋白レベルでの検討において確認された。免疫組織学的にERKおよびJNKの局在、活性について検討したところ、活性化ERKは基底細胞に、活性化JNKは有棘層上層から顆粒層にかけて認められた。以上の結果からcystatin AはERK、JNKにより発現はそれぞれ抑制、増強され皮膚においての発現はERKおよびJNKの局在の違いにより調節されていると推定した。また、乾癬においてcystatin Aの発現増強が認められるが、免疫染色、western blotによりERK, JNKが活性化されており、乾癬病態形成に関与していることが示唆された。
4)乾癬治療に使用されている各種の活性化ビタミンD3(タカルシトール、マキサカルシトール、カルシポトリオール)の角化作用に及ぼす影響についてinvolucrinなどの分化マーカーを中心に検討したところ、これらはすべて角化細胞を分化させることが明らかになった。しかし、これらの間にはその作用の違いは認めなかった。
5)活性化ビタミンD3がcystatin Aに及ぼす影響について検討したところ、転写レベルでERKによりその発現が調節されていることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] H.Takahashi et al.: "Expression of human cystatin A by keratinocytes is positively regulated via Ras/ERK/MEKK1/MKK7/JNKsinnal transduction pathway but negatively"J.Biol Chem. 276. 36632-36638 (2001)
• [Publications] H.Takahashi et al.: "Transcriptional factor AP-2 gammma increases human cystatin A"Biochem Biophys Res Commun. 278. 719-723 (2000)
• [Publications] H.Takahashi et al.: "Aberrant expression of apoptosis-related molecules psoriatic epidermis"J Dermatol Scie. 28. 187-197 (2002)
• [Publications] H.Takahashi et al.: "Similary potent action of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and its analogues, tacalcitol, calcipotriol, and maxacalcitol on normal human keratinocyte proliferation and differentiation"J Dermatol Scie. (in press).