熱失活DNA-PKの回復に対する熱ショック蛋白質(HSP)の働き

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670950
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 井原 誠 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (60175213)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥村 寛 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00073130)
• Keywords: DNA-PK / Ku70 / Ku80 / 熱失活の回復 / 熱ショック蛋白質 / HSC73

Research Abstract

温熱処理によって、DNA-PKは失活する。温熱処理後、細胞を37℃に戻して培養を行うと熱失活したDNA-PKは回復する。我々はDNA-PKの熱失活はDNA-PK複合体のKu70/80ヘテロ二量体の一方又は両方の熱失活が原因であることを明らかにしている。熱失活したDNA-PKの回復はKu70/80ヘテロ二量体の熱失活からの回復の結果と考えられる。
温熱処理した細胞をシクロヘキシミド存在下で培養しても活性の回復がみられた。このことから失活した蛋白が再活性化しており、熱失活したDNA-PKの回復には熱ショック蛋白質が関与していると考えられる。
熱ショック蛋白質の標的を調べる為に、Ku70/80ヘテロ二量体一方を高発現する細胞を作成し、どちらの細胞が温熱処理による影響が少ないかを検討した。温熱処理した細胞の抽出液を電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写し、ウエスタンブロット法で含量の変化を調べた。Ku70蛋白量は温熱処理時間に伴って減少した。一方、Ku80の量は温熱処理時間の影響を受けなかった。この結果は、Ku70の熱失活がDNA-PKの熱失活の主な原因であることが明らかとなった。
次に、HSC73を高発現させた細胞を用いて、温熱処理後の活性の回復を調べたところ、HSC73を高発現させた細胞のDNA-PK活性の回復はベクターのみを導入した細胞より早かった。このことから、熱ショック蛋白質(HSC73)が熱失活DNA-PKの回復に働いている事が確認された。