γ-secretase Assay系の構築とプレセニリンの機能解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671024
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 三浦 惠 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (60157427)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中井 俊樹 横浜市立大学, 医学部, 助手 (20270712)
• Keywords: presenilin / γ-secretase

Research Abstract

試験管内γ-secretase Assay系の構築
1.Assay系に用いる基質の作製(三浦)
APPのβ-secretase切断部位からC末端までの領域(APPC100)の下流にHatag配列あるいは大腸菌のLeadePeptidaseの一部の配列を融合したタンパク質(APPC100-HA 及びAPPC100-LP)をコードする遺伝子をp c DNA3.1(+)ベクターに組み込み、T7 RNApolymeraseでmRNAを作製した。
2.プレセニリン複合体の調製(三浦、中井)
プレセニリン複合体はラット肝、培養細胞より細胞分画法によりミクロソーム画分を調製後,さまざまな界面活性剤で可溶化し、1991年に報告されたBlue Native Electrophoresisで解析した結果、γ-secretase活性を保持したまま複合体が調製出来ることが報告されているCHAPSOとほぼ同サイズの複合体がジギトニン処理によっても得られることを明らかにした。
3.Assay系の構築(三浦)
1で作製したベクターよりmRNAを作製後、ウサギ網状赤血球ライセートを用いた蛋白質合成系で基質を35Sメチオニンで標識し、2で調製したプレセニリン複合体と保温後SDS-PAGEで展開し、解析したが現在の所、processed formを確認するには至っていない。γ-secretase活性を検出するための最適条件を検討中である。