ミトコンドリア由来スーパーオキサイド産生制御による糖尿病性血管合併症の抑制

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671195
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 豊永 哲至 熊本大学, 医学部, 助手 (60295128)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 栄一 熊本大学, 医学部, 教授 (10253733) ; 宮村 信博 熊本大学, 医学部・附属病院, 助手 (40274716) ; 西川 武志 熊本大学, 医学部, 助手 (70336212)
• Keywords: 糖尿病 / 血管合併症 / 活性酸素 / ミトコンドリア / マンガネーゼスーパーオキサイドジスムターゼ / トランスジェニックマウス

Research Abstract

申請者らは糖尿病血管合併症発症機序として「高血糖によるミトコンドリア電子伝達系からのスーパーオキサイド過剰産生」の意義を提唱しているが、この仮説を生体内で証明する事、また、この仮説に基づく治療の可能性を検討することを目的として、本年度は以下の1,2を行った。
1.MnSODトランスジェニックマウス開発(ヒトMnSOD遺伝子発現ベクターの作成)
ヒトMnSOD特異的なプライマーを作成し、cDNAライブラリーよりMnSOD遺伝子の全長をクローニングした。得られたMnSOD遺伝子に標識用Tagを付加して発現ベクターへ組み込み、この発現ベクターを培養細胞へ導入した。活性のあるMnSOD蛋白が発現することをwestern blot法およびMnSOD活性測定にて確認した。
2.糖尿病の導入と糖尿病マウスでの細胞外気質蛋白遺伝子の発現量解析
CDIマウスへのストレプトゾシン0.1mg/g BWの2回腹腔投与により、血糖値約400mg/dlと糖尿病の発症を確認した。4週間飼育し、定期的な血糖、体重測定を行った。血糖値は期間中持続して高値であった。
次に糖尿病で増加が報告されている細胞外気質蛋白である4型コラーゲン、ファイブロネクチンのmRNA発現量を糖尿病血管合併症発症・進展の指標として、リアルタイムPCR法にて測定する系を構築した。糖尿病マウスにおいてコントロールマウスに比し、腎糸球体組織中の4型コラーゲンmRNAは約2倍、ファイブロネクチンmRNAは約1.5倍高値であることを確認した。本法は非常に少量のサンプルで、また、簡便にその発言量を定量することが可能であり、MnSODトランスジェニックマウス作成後の合併症進展度評価のためにも非常に有用と考えられた。