分子生物学手法を用いた角膜真菌症迅速診断法の開発と治療指針の作成

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671841
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 塩田 洋 徳島大学, 医学部, 教授 (20035736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 禎子 徳島大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 田近 智之 徳島大学, 医学部, 助手 (30325253) ; 江口 洋 徳島大学, 医学部・附属病院, 助手 (30314868)
• Keywords: 角膜真菌症 / 遺伝子診断 / ゲノム / PCR / PCR-SSCP / カンジダ / フザリウム

Research Abstract

角膜真菌症は,早期に診断を下し早期に治療を開始する必要がある。しかし現実には診断に苦慮し,薬剤感受性試験には3-4週間を要している。我々は分子生物学的手法を用い,角膜真菌症迅速診断法の開発と治療指針の作成を試みた。
1.遺伝子解析用プライマーの作成:Gene Bankのデータや文献を参考に,真菌共通の18S rRNA遺伝子をターゲットにしたプライマー,Fusarium属にはcutinase遺伝子を,Aspergillus属には18S rRNA遺伝子を,Candida属にはcytochrome P450 L1A1 demethylase遺伝子をターゲットにしたプライマーを作成した。これらのプライマーについて,千葉大学真菌医学研究センターから提供を受けた標準株6株をコントロールとして使用し,プライマーの有用性を検証した。またPCR法の条件も種々検討し,最適な条件を見つけた。ポイントはプラライマーによりannealing温度に差を付けたことであった。
2.角膜真菌症症例の検討:我々が保存していた過去の角膜真菌症症例の擦過標本プレパラート及び分離保存真菌からDNAを抽出し,上記プライマーを用いてPCR法を行った結果と従来の形態学的判定結果とを23症例において比較検討した。20症例において,同定結果は一致した。形態学的に未判定であった3症例中の1例は,PCR法にてFusarium属と同定出来た。
これらの結果は,角膜真菌症の疑いのある患者を診た際,病巣部を擦過し我々のPCR法に準じて行えば,1晩で角膜真菌症と診断が出来,場合によっては菌種の同定まで出来ることを示している。菌種の同定が出来れば,有効な薬剤を選択することが出来る。現在これらの結果を実際の臨床に応用し始めている所である。