2003 Fiscal Year Annual Research Report
難治性根尖性歯周炎にむける血管内皮細胞が好中球の一酸化窒素産生に及ぼす影響
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13672013
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
武市 収 日本大学, 歯学部, 助手 (10277460)
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| Keywords | 難治性根尖性歯周炎 / 血管内皮細胞 / 好中球 / 一酸化窒素 / 誘導型一酸化窒素合成酵素 / L-アルギニン誘導体 / RT-PCR法 / Southern hybridization法 |
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| Research Abstract |
1.L-アルギニン誘導体による一酸化窒素(NO)の合成阻害
1)ヒト臍帯静脈血内皮細胞(HUVEC)をLPSおよびIL-1αまたはIFN-γで刺激し、その後末梢血好中球(PB-PMNs)との共培養系に添加した。得られた培養液中のNO濃度をGriess試薬を用いて測定したところ、10.25μMであった。
2)1)の共培養系にL-アルギニン誘導体であるL-NMMAを添加し、得られた培養液中のNO濃度を測定したところ7.02μMであり、アルギニン誘導体の添加でNO合成が有意に低下した。
2.誘導型NO合成酵素(iNOS)遺伝子発現の検索
通法に従い、共培養したHUVECならびにPB-PMNsからRNAを分離し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いて相補的なDNAを作成したのち、ヒトiNOS特異的PCRプライマーとDNA合成酵素を用いたPCR法により、iNOSmRNAの遺伝子発現を検索した。その結果、iNOS遺伝子の発現を認めた。
3.Southern hybridization法
2.で得られたPCR反応産物をナイロンメンブレン上にSouthern transferし、ヒトiNOS特異的インターナルプローブを作成したのち、非ラジオアイソトープを用いたSouthern hybridization法をおこなった。得られたオートラジオグラフィー上でiNOSのインターナルプローブとハイブリダイゼーションしたシグナルを確認し、PCR法の特異性を確認した。
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