エビチキン―プロテアソーム経路によるCDKインヒビターp21の認識機構の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672430
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 福地 邦彦 昭和大学, 医学部, 助教授 (70181287)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 五味 邦英 昭和大学, 医学部, 教授 (60053980)
• Keywords: p21 / ubiquitin / His tag / リン酸化 / cyclin kinase inhibitor

Research Abstract

正常なcell cycle進行は、cyclinおよびcyclin kinase inhibitorの転写制御とubiquitin-proteasomeによる分解制御機構がcell cycle依存的に作動することにより行われる。今回、p21-ubiquitinationにおけるp21分子上の制御領域の解析を行った。p21は164アミノ酸残基から構成され、CDK2の基質となる98SPと130SP、および、Protein kinase Cの基質となる153SKRと160SKRが存在する。一般にubiquitinationは基質のリン酸化に制御されるので、C-terminalから順次それぞれのリン酸化siteを除去した、1-128aa,1-147aa,1-157aaのHis-tag C-terminal truncated fragmentおよびHis-tag full length p21を真核細胞に発現させ、ubiquitinationの有無を検討した。すべての発現で、Ni精製後のcell lysate中のWestern blotにおいて、当該分子量の位置に、C-terminal truncated fragmentのbandを検出した。このなかで、full lengthおよび1-157aaの発現では、tag-p21よりも高分子量領域に、anti-p21 antibodyとanti-tag antibodyにより検出されるband ladderを認めた。このband ladderはanti-ubiquitin antibodyで検出され、ubiquitinated p21であることが示された。以上の結果から、p21の効率的なubiquitinationには、C-terminalの153SKRを含む147-157aa領域がessentialであることが明らかとなった。