無細胞翻訳系によるセレノメチオニン標識タンパク質の生産とX線結晶構造解析への応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680692
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 堀 弘幸 愛媛大学, 工学部, 助教授 (20256960)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 澤崎 達也 愛媛大学, 工学部, 助手 (50314969)
• Keywords: 翻訳 / X線結晶構造解析 / 多波長異常分散法 / セレノメチオニン

Research Abstract

無細胞翻訳系によるセレノメチォニン(SeMet)標識を、クラゲ蛍光タンパク質(GFP)および大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として検討した。その結果、いずれのタンパク質も、メチオニン(Met)を用いた通常の合成量に匹敵する量で合成が可能であった。合成したタンパク質中のSeMet置換は、液体クロマトグラフィー質量分析により確認した。全液体クロマトグラムを精査しても、内在性Metによる該当ペプチドを検出できなかったことから、SeMet置換量はほぼ100%に近いことが確認された。また、この過程でSeMet標識タンパク質を、-80℃で6ヶ月間保存してもSeMet基が酸化を受けないことも確認された。
GFPの発色団形成は、通常のメチオニン標識よりもややスローであったが、その蛍光スペクトルはSeMet-GFPとMet-GFP間でよい一致をしめした。この結果は、少なくとも発色団近傍のタンパク質立体構造形成にSeMet標識が何も影響を与えないことを示している。また、DHFRの場合、Met残基の位置が触媒機構上重要なMet20-ループに含まれることから、触媒活性への影響が懸念されたが、これもぼぼ同等の活性を有することが確認された。
これら、モデルタンパク質による標識の検討を終え、X線構造解析に着手しているtRNA修飾酵素のSeMet導入部位検索に利用した。現在、本酵素は3A解像度で構造精密化を行なっている。
よって、無細胞翻訳系により、高効率でSeMet標識が可能であることが確認され、x線結晶構造解析への応用が可能なものと考えている。本研究の一部は、日本生化学会および分子生物学会において発表した。

Research Products

• [Publications] Kazunori Watanabe, Hiroyuki Hori, Yaeta Endo: "Identification of essential amlnoacid residues of tRNA (Gm18) methyl-transferase for methyl-transfer activity"Nucleic Acids Research Supplement. 1. 33-34 (2001)
• [Publications] Hiroyuki Hori, et al.: "Identification and characterization of tRNA (Gm18) methlytransferase from Thermus thermophilus HB 8 : domain structure and conserved amluo acid sequence notifs."Genes To Cells. 7(9名中第1著者)(印刷中). (2002)