超好熱菌のゲノム情報に基づくNAD生合成経路の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680716
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 櫻庭 春彦 徳島大学, 工学部, 助教授 (90205823)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大島 敏久 徳島大学, 工学部, 教授 (10093345)
• Keywords: 超好熱菌 / Pyrococcus horikoshii / アーキア / NAD / ゲノム情報 / L-アスパラギン酸オキシダーゼ / X線結晶構造解析 / L-アスパラギン酸脱水素酵素

Research Abstract

嫌気性超好熱アーキアpyrococcushorikoshiiのゲノム情報から予想されるアミノ酸配列が大腸菌のL-アスパラギン酸オキシダーゼに高い相同性(35.1%)を示す遺伝子が存在することを見出した。この遺伝子の大腸菌における発現系を構築し、産物の機能解析を行ったところ、本酵素がL-アスパラギン酸オキシダーゼ活性を持つこと、及び90℃まで失活しない高度耐熱性を示すことが明らかになった。これは超好熱菌から見出された最初のオキシダーゼである。機能解析を進めた結果、本酵素が嫌気条件下で酸素の代わりにフマル酸、フェリシアンカカリウムなどを電子受容体とするL-アスパラギン酸脱水素反応を触媒することが明らかとなった。生理的には本反応がL-アスパラギン酸の酸化により生じたFADH_2をFADに再生すると考えられる。本酵素の結晶化に成功し、現在、X線結晶解析による三次元構造の解析を行っている。約2.8Åの分解能でネイティブの回折像を得、永銀および白金を用いた重原子誘導体について約3.3〜3.5Åの分解能で回折像を得たので、多重重原子同型置換法による位相決定を試みている。空間群はC222_1と考えられる。本酵素は、P. horikoshiにおいてNAD生合成の初発酵素として機能すると考えられる。一方、本菌においてホモログが見いだされたL-アスパラギン酸オキシダーゼ以外のNAD生合成系の関連酵素、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼおよびNADシンターゼに関し、その全ての大腸菌における大量発現系の構築に成功した。現在、それぞれの酵素の機能解析を進めている。これらの酵素の安定性は非常に高く、その機能解析は生合成経路の解明に非常に有効である。また、この機能解析は、超好熱アーキアの経路だけでなくヒトを含めた全生物のNAD生合成経路の解明を用意にし、進化面の情報も提供してくれることが期待できる。

Research Products

• [Publications] Haruhiko Sakuraba: "L-Aspartate oxidase is present in the anaerobic hyper-thermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT-3:Characteristics and role in the de novo biosynthesis of NAD proposed by genome sequensing"Extremophiles. (in press).
• [Publications] 櫻庭 春彦: "ゲノム情報から見えた超好熱菌のNAD生合成系 -酵素の構造や機能、そして進化についての新たな情報に期待-"化学と生物. 39・12. 774-776 (2001)