ε型Cキナーゼによるケラチン構造の制御と生理機能の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680729
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 秋田 朗子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (40124432)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川崎 博史 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助教授 (70169704)
• Keywords: プロテインキナーゼC / ケラチン / 細胞骨格 / リン酸化 / ホルモン / 細胞内情報伝達機構 / プロテオーム解析 / 質量分析

Research Abstract

プロテインキナーゼC(PKC)は、12種類の分子種からなる蛋白質リン酸化酵素群である。我々はこれらのクローニングで発見した分子の構造と機能について解析し、今までにホルモン分泌や、細胞の増殖と分化、また、細胞死の決定等にPKCが分子特異的に関与する事を示してきた。特に、生理的な刺激応答系の解析では、脳下垂体腫瘍由来のGH細胞株のホルモン分泌系において、ε型PKCが視床下部ホルモンTRH(thyrotropin-releasing hormone)刺激で強く活性化され、中間径繊維構造のケラチン8(K8)をリン酸化することを見出している。本研究は、ε型PKCの細胞内基質として同定したII型ケラチンのK8に焦点をあて、ε型PKCの活性化以降の分子作用機構と単層上皮系中間径繊維構造の生理機能について明らかにすることを目的として平成13年度より開始した。
本年度は、TRHおよびホルボールエステル刺激によるリン酸化動態について、ε型PKCを過剰発現させたGH細胞株を作成してプロテオーム解析を行い、PKCを介したcofilin/destrinの活性化がMARCKSの活性化と、共同してアクチン系細胞骨格構造の再編成を促進していることを示唆する結果を得た。また、ケラチン8のホルモン刺激によるリン酸化動態は極めてダイナミックな変化であり、ε型PKCを介したリン酸化とオカダ酸感受性ホスファターゼによる脱リン酸化が昂進していることが示唆された。更に、免疫沈降と二次元電気泳動によってケラチンを精製し、MALDI-TOF/MSとナノスプレータンデムMSによる解析で、約80%のアミノ酸配列を同定した。これらの領域は、ケラチン構造の中央部に位置するRODドメイン全域を覆っており、リン酸化されていない領域であった。現在N末のHeadドメインとC末のTailドメインに存在するリン酸化部位を検索中である。

Research Products

• [Publications] Yokoyama, A. et al.: "Identification of major phosphorylation sites of Epstein-Barr Virus nuclear antigen leader protein (EBNA-LP): Ability of EBNA-LP to induce latent membrane protein 1 cooperatively with EBNA-2 is regulated by phosphorylation."J. Virology. 75. 5119-5128 (2001)
• [Publications] Yokoyama, A. et al.: "Mesurament of aspartyl aminopeptidase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrormetry."Analytical Sciences. (in press).
• [Publications] Iwafune, Y. et al.: "Electrophoretic analysis of the post-translational modification of yeast 20S proteasome."Electrophoresis. (in press).