ε型Cキナーゼによるケラチン構造の制御と生理機能の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680729
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 秋田 朗子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (40124432)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川崎 博史 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助教授 (70169704)
• Keywords: プロテインキナーゼC / ケラチン / リン酸化 / プロテオーム解析 / 質量分析 / ホルモン / 中間径線維 / 細胞骨格

Research Abstract

プロテインキナーゼC(PKC)は、12種類の分子種からなる蛋白質リン酸化酵素群である。本研究は、ε型PKCの生理的基質として同定したII型ケラチンに焦点をあて、ε型PKCの活性化以降の分子機構と細胞骨格繊維構造の生理機能について明らかにすることを目的として、平成13年度より開始した。昨年度は、脳下垂体腫瘍由来GH細胞のホルモン刺激応答系をモデル系として用い、ε型PKCを過剰発現させたGH細胞株を作成して、視床下部ホルモンのTRH (thyrotropin-releasing hormone)刺激によるリン酸化動態についてプロテオーム解析を行い、PKCを介した間接的なcofilin/destrinの活性化(脱リン酸化)とε型PKCによるMARCKSの直接的活性化が起こることを示した。
本年度は、これら蛋白質の活性化と共にアクチン系細胞骨格構造の再編成が促進ざれ、細胞の形態を変化させることを示唆する結果を得た。更に、PKC分子種の精製標品によるin vitroリン酸化実験により、II型ケラチンがε型PKC特異的にリン酸化されることを示した。また、免疫沈降と二次元電気泳動によって非リン酸化とリン酸化ケラチンを分離精製し、MALDI-TOF/MSとナノスプレータンデムMSによる詳細な質量分析で、約80%のアミノ酸配列を同定した。これらの領域は、ケラチン構造の中央部に位置するRODドメイン全域とN末のHeadドメインの約半分とC末のTailドメイン約半分を覆っており、リン酸化されていない領域であることが示唆された。そこで、N末のペプチドを合成してin vitroによるリン酸化の解析を行い、II型ケラチンのHeadドメインN末領域にε型PKCによるリン酸化部位が存在することを明らかにした。

Research Products

• [Publications] Akita, Y.: "Protein kinase C-ε (PKC-ε) : Its unique structure and function"J. Biochem.. 132. 847-852 (2002)
• [Publications] Kitagawa, K. et al.: "The second phase activation of protein kinase C d at late GI is required for DNA synthesis in serum-induced cell cycle progression"Genes to Cells. (In press).
• [Publications] Pickett, C. A. et al.: "Role of specific isozymes in mediatng epidemal growth factor, thyrotropin-releasing hormone, and phorbol ester regulaiton of the rat prolactin promoter in GH4/GH4Cl pituitary cells"Mol. Endodrinol. 16. 2840-2852 (2002)
• [Publications] Iwafune, Y. et al.: "Electrophoretic analysis of the post-translational modification of yeast 20S proteasome"Electrophoresis. 23. 329-338 (2002)