Rhoキナーゼの自己阻害機構の構造的基盤

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680742
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 清水 敏之 横浜市立大学, 総合理学研究科, 助教授 (30273858)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 箱嶋 敏雄 奈良先端科学技術力学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (00164773)
• Keywords: Rho-キナーゼ / 自己阻害 / DHドメイン / Rho / X線結晶構造解析 / 立体構造 / コイルドコイル

Research Abstract

マウス由来のRhoキナーゼのキナーゼドメイン(一部コイルドコイル領域を含む)はSf9細胞を利用したバキュロウイルスの発現系によりタンパクを発現させ、精製した。その結果、純度の高い(95%以上)数mg程度の結晶化可能量を取得することに成功した。一般的に溶液が単分散系であれば結晶化する確率が高いことが知られているのでX線小角散乱法により溶液の分散状態を調べた。その結果、Rhoキナーゼの溶液は単分散系でありさらに四量体をとっていることが示された。この分子量の結果はゲルろ過により推定される結果と一致した。またマススペクトル、ペプチドシークエンサーにより予定通りの蛋白質を得ていることを確認した。この試料を幅広いpH、様々な沈殿剤・塩を含んだ結晶化スクリーン試薬を用いて結晶化条件を検討した。その結果微小な結晶が得られている。現在これがRhoキナーゼの結晶であるかどうか再現実験を行っている。
一方コイルドコイルドメインとPHドメインを含む自己阻害領域であるRhoBD(PH)は大腸菌の発現系を用いてタンパクを取得しようとしている。しかしながらRhoBD(PH)は沈殿画分に行きやすいことが判明したため、培養温度や誘導のタイミング、誘導物質(IPTG)の濃度など色々な条件を試したがそれほど改善されなかった。さらに精製途中で分解されやすい傾向にあるのでプロテアーゼ阻害剤の使用など精製条件を検討しているところである。

Research Products

• [Publications] Shimizu, T. et al.: "Strctural basis for Neurofibromatosis Type2:Crystal structure of the Mexlin FERM domain"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [Publications] Hamada, K. et al.: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of RhoGDI in coaplex with the radizin FERM domain"Acta Crystallogr. D57. 889-890 (2001)
• [Publications] Hamada, K. et al.: "Crystallographic characterization of the radixim FERM domain bound to the cytcplacmic taol of the adhesion protein ICAM2"Acta Crystallogr. D57. 891-892 (2001)
• [Publications] 清水: "転写因子の構造生物学"細胞工学. 20. 1359-1363 (2001)
• [Publications] 清水: "シグナル伝達分子の機能制御機構"蛋白質・核酸・酵素. 46. 1950-1955 (2001)