DNA結合蛋白質スライディングにおけるGroove-trackingの1分子検証

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680753
• Research Institution: RIKEN
• Principal Investigator: 十川 久美子 理化学研究所, 免疫制御モジュール研究チーム, 研究員 (20291073)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 嶋本 伸雄 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 教授 (20127658)
• Keywords: DNA結合蛋白質 / 非特異的複合体 / スライディング / RNAポリメラーゼ / 光ピンセット / 1分子操作 / 蛍光観察

Research Abstract

昨年度構築したDNAの回転を検出する1分子実験系を用いて、RNAポリメラーゼがスライディングする過程における.Groove-trackingを検証する実験を行った。実験系の概要は以下の通りである。RNAポリメラーゼをDNA結合活性を維持してガラスに固定した。ビーズに一端を固定したDNAの自由端を結合し、ビーズをDNAでtetherした、ビーズをガラスから一定の高さに光ピンセットで保持し、ガラスを一定速度で動かすことで、ガラス上のRNAポリメラーゼに対して、DNAをなぞった。その際のビーズの動きを微小蛍光マーキングにより観察、記録した。蛍光マーキングの動きを解析し、回転運動を検出するための2つの指標を定義し、算出した。一つは、蛍光マーキングの分布から得られるdelta-Rで、ビーズの動きに回転軸があることを示す指標である。もう一つの指標は、蛍光マーキングの位置の時間変化を調べることにより得たRotational Indexで、同方向の回転運動の程度を示す。本実験の他に、コントロール実験として、(1)DNAがない場合、(2)RNAポリメラーゼとDNAの相互作用を妨げるcompetitorを入れた場合、(3)ガラスを停止した場合、について実験を行い、2つの指標を比較した。その結果、competitor存在下ではビーズの回転が抑えられ、ランダムな動きが増加することから、RNAポリメラーゼとDNAの相互作用による回転を検出していることが確認できた。また、本実験は、ガラスを停止させた場合に比べて、回転運動が多くなった。この差は、ガラスを動かして、RNAポリメラーゼとDNAの相対的動きを加えることにより生じたと考えられ、Groove-trackingによる回転を検出していると示唆される。
以上の結果から、Groove-trackingの検証を行うことができた。

Research Products

• [Publications] Sakata-Sogawa, K., Shimamoto, N.: "Detection of Tracking a DNA Groove by RNA Polymerase during Sliding"Biophys.J.. 82(1). 85a (2002)
• [Publications] Sakata-Sogawa, K., Shimamoto, N.: "Single-molecule Detection of Groove-tracking of DNA by RNA polymerase during sliding"Proc. of 7^<th> Asian Conference on Transcription. 42 (2002)
• [Publications] Susa, M., Sen, R., Shimamoto, N.: "Generality of the branched pathway in transcription initiation by E.coli RNA polymerase."J.Biol.Chem.. 277. 15407-15412 (2002)