2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13740470
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Research Institution | Okazaki National Research Institutes |
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Principal Investigator |
村田 隆 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助教授 (00242024)
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| Keywords | 表層微小管 / γ-チューブリン / タバコBY-2細胞 / RNAi |
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| Research Abstract |
当初計画では微小管の配向変化を誘導できる実験系の確立と、電子顕微鏡観察の試料作成法の検討をまず行い、その後で微小管の重合/脱重合を実験的に制御した時の微小管配列に対する影響を調べる予定であった。しかしながら、近年の分子生物学的手法の発展により、微小管の重合を阻害するための実験的手法としてRNAi法によるγ-チューブリンの合成阻害が有力になってきたため、まずRNAi法がγ-チューブリンの合成阻害に使えるか否かを検討した。
Fad2遺伝子のイントロンを間に挟み、γ-チューブリン遺伝子断片(367bp)のセンス鎖とアンチセンス鎖が逆向きにつながって転写される組み換えDNA(RNAiコンストラクト)を作製した。このRNAiコンストラクトは転写後にイントロンが切断され、2本鎖RNAとなって内生のγ-チューブリンmRNAを破壊することが期待される。タバコBY-2培養細胞を材料に用いてパーティクルガン法により一過的に遺伝子導入を行った。現在のところ、RNAコンストラクトを導入すると、遺伝子導入マーカーとして同時に導入したGUS遺伝子の発現が検出されなくなる問題が発生しており、γ-チューブリン遺伝子の発現が抑制されるか否かの結論は出ていない。実験を困難にしている原因として、パーティクルガン法では遺伝子導入効率が数%以下のため、マーカー遺伝子を導入しないと観察ができないことがあげられる。そこで、誘導プロモーター系を用いて、特定の条件下でのみRNAiコンストラクトを発現する安定形質転換体を現在作成中である。
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