B型肝炎ウイルスの免疫応答からのエスケープ機構の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13770285
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 静間 徹 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (20307523)
• Keywords: B型肝炎ウイルス / 抗原提示細胞

Research Abstract

(1)まず、HBVcoreおよびHBVx蛋白の作成を行った。
本研究では、TAPの機能に影響を及ぼす蛋白が、HBVcoreあるいはHBVxにあると想定し、まず精製したコアおよびX蛋白を作成した。コアおよびX遺伝子PCRで増幅し、その産物をpQE32 vectorに挿入し、His-taggedのfusion proteinを作成した。つぎに、Ni-NTA spin columnを用いて蛋白を精製した。この蛋白をNew Zealand White rabbitに免疫して、ポリクローナル抗体を作成した。
(2)peptide translocation assay
TAPの機能に及ぼすHBV蛋白の影響は、peptide translocation assayにHBVcoreおよびHBVx蛋白を添加して調べた。細胞は、lymphoblastoid cell line(Hom2)を用いた。培養細胞にstreptolysin Oを加えてpermeabilizeしたのちradioiodinateしたpeptide libraryを添加した。こののち精製したコア及びX蛋白を添加し1、3、5日間培養した。培養した細胞を、lysis bufferにて可溶化した後遠心分離し、その上清をCon A-Sepharose beadsとincubateして、最終的にradiolabelされ、glycosilateされた分画をgamma-counterで測定する。現在、本実験を行っているところである。
今後、HBV蛋白の影響であることを確認するためには、HBVcore, HBVx蛋白を細胞に添加した後に、trypsinを加えて、蛋白の効果が減弱されるかどうかにより確認する。