パッチクランプ法による細菌細胞のイオントランスポーターの解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13780536
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 黒田 照夫 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助手 (80304327)
• Keywords: パッチクランプ法 / 大腸菌 / トランスポーター / 多剤排出ポンプ / アミノ酸輸送

Research Abstract

パッチクランプ法によってイオントランスポーターの解析を行うために、宿主大腸菌の巨大化条件を決定した。さまざまな条件検討を重ねた結果、パッチクランプ法を適用するために十分な大きさ(直径10μm以上)にまで巨大化させることができた。目的のアミノ酸トランスポーターSstTを発現させた株も巨大化することに成功した。しかしIPTGによって発現を誘導してもSstTタンパク質があまり誘導されず、逆に誘導していない状態でも無視できないレベルで発現していた。これはSstTの発現調節が厳密にコントロールできていないことを意味し、現在用いているtrcプロモーターは上記培養条件においては不向きであることが示唆された。そこでアラビノースプロモーターを利用できるように系を再構築している。また一方では大量発現したSstTの精製方法を確立し、幾つかの性質について調べた(Kim, submitted)。
Na+/薬剤排出タンパク質NorMについてはSstTの結果を元に今後行う予定にしている。その一方で、新たに2つのNa^+駆動性の多剤排出ポンプの遺伝子をクローニングし、その性質にいて調べた(Huda,2001,Chen,2002)。このう'ち一つは上記NorMと相同性が高い。これらについても同様にパッチクランプ法に適用できるよう、系を構築している。
当初の研究計画では、パッチクランプ法による解析を東京大学にて14年度に行うと記述していた。しかし東京大学分子細胞生物学研究所より、パッチクランプシステム一式を譲り受けることができた。そこで現在、岡山大学で使用できるようにセットアップを行っている。進行状況から考えて13年度末あるいは14年度の早い段階で、使用可能となると予想される。このセットアップにかなりの時間が費やされているが、セットアップが完了すれば、14年度の計画を実行する予定である。

Research Products

• [Publications] Huda, MN. et al.: "Na^+-driven multidrug efflux pump VcmA from Vibrio Cholerae non-O1, a non-halophilic bacterium"FEMS Microbiological Letter. 203(2). 235-239 (2001)
• [Publications] Chen, J. et al.: "VmrA, a member of a novel class of Na^+-coupled multidrug efflux pumps from Vibrio parahaemolyticus"Journal of Bacteriology. 184(2). 572-576 (2002)