2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13780585
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
箕田 康一 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助手 (50281845)
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| Keywords | アフリカツメガエル / 卵成熟 / Daz-like遺伝子 / 翻訳制御 |
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| Research Abstract |
1. 以下の2つの手法を用いて、Xdazl蛋白質が結合するRNAの特定を目指した。
(1)SELEX法による、in vitroでのRNA選別
ランダムな25塩基の配列を持つRNAプールを合成し、GSTタグの付いたXdazl組換え蛋白質(GST-Xdazl)と反応させた。GSTタグを利用してGST-Xdazl蛋白質とRNAの複合体を反応液から回収し、結合しているRNAを抽出、cDNAに逆転写してPCRで増幅した。増幅したcDNAは次のサイクルのRNA合成の鋳型として用い、RNAの選別を繰り返した。7サイクルの選別を行った後、得られたcDNAの塩基配列を決定し、Xdazl蛋白質が結合するRNAに共通の塩基配列を決定した。
(2)免疫沈降法による、ツメガエル卵細胞からのmRNAの精製
抗Xdazl抗体を用いた免疫沈降法により、ツメガエル卵母細胞からXdazl蛋白質に結合しているRNAを直接回収し、クローニングした。得られたcDNA断片の塩基配列をデータベース検索し、ターゲットとなるmRNAの候補を幾つかに絞り込んだ。
現在、候補としてあげたmRNAと、Xdazl蛋白質との結合可能の有無を、UV-crosslink法で確認する作業を進めている。更に、変異を入れたmRNAに対する結合能の変化を調べ、Xdazl蛋白質のターゲットとなるmRNAの特定を目指す。
2. 成熟卵型のXdazl蛋白質(分子量40kDa)を脱リン酸化処理すると、未成熟卵型と同じ37kDaに戻った。また、未成熟卵型のXdazl蛋白質を脱リン酸化処理しても、移動度に変化は無かった。従って、卵成熟に伴うXdazl蛋白質の修飾は、リン酸化による。
現在、RNA結合力に及ぼすリン酸化の影響をin vitroの系で調べている。
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