2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13876033
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
福岡 伸一 京都大学, 農学研究科, 助教授 (20183923)
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| Keywords | スクレイピー / ディファレンシャルディスプレイ / 核酸分解酵素 / ミクロソーム / 細胞分画 |
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| Research Abstract |
スクレイピー罹患マウスの脳および対照として非罹患健常マウスの脳を採取し、テフロンホモジナイザーで処理した。低速遠心条件で細胞分画を行い、宿主核酸が含まれる核およびミトコンドリアを除去した。次に超遠心条件で細胞分画を行い、ミクロソーム画分を除去した。超遠心上清に、RNaseを加え、宿主由来の核酸を加水分解した。その後、核酸分解酵素を特異的に不活性化し、SDSとプロテネースKで処理した。罹患した動物組織の感染性を不活性化する方法として、強アルカリ処理、長時間プロテアーゼ処理などがあり、実験に使われた器具類は全てこの方法で処理した。
得られた核酸画分をもとに、遺伝子ライブラリーを作成した。
また、この画分をテンプテートとしたディファレンシャルディスプレイを、9種の下流プライマーと24種の上流プライマーを使って行った。結果をPAGEで解析し、バンドは放射性同位元素で標識した。この結果、スクレイピー罹患マウス脳で発現の増幅を認めた遺伝子断片を約100種同定した。この核酸断片を乾燥させたゲルから抽出し、特異的プライマーによる再増幅のあと、TAクローニングによるサブクローン化を行い、うち30クローンについて核酸配列を解析した。今後、さらに残りの断片のクローン化と配列解析を行い、さらにPCRを用いて罹患と同調して変動する遺伝子の動態を解析する。
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