培養胎仔鼻板のGnRHニューロンを用いてGnRHサージ発生器を作成する試み

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13877011
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 田中 冨久子 (貴邑 冨久子) 横浜市立大学, 医学部, 教授 (40046066)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 美津島 大 横浜市立大学, 医学部, 講師 (70264603) ; 舩橋 利也 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (70229102)
• Keywords: エストロジェン / 培養 / 鼻板 / GnRHサージ / GABA / bicuculline / GT1-7 / serum shock

Research Abstract

我々が既に確立した方法により、13.5日齢の胎仔鼻板を25%血清含有培養液で回転培養し、2-5週間後に実験に用いた。実験前日に10%血清含有培養液に交換した。サンプリングは、10分間隔で5時間にわたり909μlの全培養液を回収し、新しいものと交換することにより行った。サンプリング前日もしくは72時間前より1-100nMエストロジェンを培養液中に投与した。100μMのGABA_A受容体アンタゴニスト、ビククリンをサンプリング開始2時間後より2時間にわたり培養液中に投与した。回収した培養液中のGnRH濃度を、高感度EIAにより測定した。その結果、培養2週間目の実験では、エストロジェンの有無、投与期間にかかわらず、ビククリン投与によりGnRH分泌が増加した。しかし、この分泌増加は、1)エストロジェン依存性ではないこと、2)増加量はそれほど多くないこと、から、サージ状GnRH分泌とは認められないと考えられた。この原因の一つとして培養期間が短くGnRHニューロンがサージ発生器に分化出来なかった可能性を考え、培養期間を延長し、同様の実験を行った。その結果、培養5週間目の実験では、ビククリンによりGnRH分泌は増加したものの、培養2週間目と比較して、大きな違いは認められなかった。現在、さらに培養期間を8週間にして検討を行っている。
一方、視床下部GnRHニューロン由来の細胞株で、パルス状にGnRHを分泌することが知られているGT1-7細胞を用いて、サージ状のGnRH分泌が惹起できるか否かも検討した。定型的に5%CO2存在下で5%牛胎仔血清添加D-MEM/F12にて培養し、ある種の細胞株にサーカディアンリズムを惹起することが知られている50%血清刺激を4時間行った。4時間間隔で培養液を回収し、GnRH濃度を測定した。その結果、血清刺激8-12時間後に、前値と比較して約5倍のGnRH分泌の増加が認められた。今後エストロジェン刺激によっても同様のことが起こるのか検討する予定である。