蛍光共鳴エネルギー転移を応用したイノシトール三リン酸の細胞内動態のイメージング

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13877314
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 東城 庸介 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (00305913) ; 森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (20326549) ; 谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (70217149)
• Keywords: FRET / イノシトール三リン酸 / GFP / CFP / YFP / イメージング

Research Abstract

1.GFPで標識したPLC-PHドメインを培養細胞(HSY細胞、MDCK細胞)に発現させ、細胞膜GFPの細胞質へのトランスローケーションからIP_3産生をモニターした。アゴニスト刺激によりわずかな分布変化が観察されたが、その反応は必ずしも明確ではなかった。
2.IP_3の可視化の予備実験として、Yellow CamereonをHSY細胞に発現させ、FRETによる細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]I)の測定を行った。ATPやイオノマイシンで刺激したところ、カルシウム・オシレーションや持続的な[Ca^<2+>]Iの上昇が観察された。
3.PKCαの遺伝子の5'末端と3'末端に、それぞれCFPとYFPの遺伝子を融合させたキメラタンパク発現ベクターを作成した。このベクターを用いて融合タンパク質(CY-PKCα)をHSY細胞に発現させた。イオノマイシンでCY-PKCα発現細胞の[Ca^<2+>]I上昇させると、CY-PKCαが細胞膜へ移動し、それに伴ってCY-PKCαの分子間FRETによりCFP/YFPの蛍光比が低下した。CY-PKCをαはPKCαの分子構造の変化の解析には適さないと考えられるが、分子間相互作用の解析に利用できる可能性がある。