7回膜貫通型受容体におけるG蛋白質活性化部位の最小単位同定とその立体構造解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13877366
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 松本 治 京都大学, 薬学研究科, 助教授 (10231599)
• Keywords: 7回膜貫通型受容体 / G蛋白質 / 活性部位 / ペプチド / 立体構造解析

Research Abstract

一次構造の判明したオーファント7回膜貫通型受容体について、その膜貫通部位をプログラム(SOSUI, TopPred, TMHMM等)を用いて予測した。その結果Gタンパク質活性化能が高いといわれている細胞内第3ループの位置はすべてのプログラムでほぼ同じであった。そのループ内において特にGタンパク質活性化能の強い部分を特定するためにループ内の様々な部分について検討し、その、一部分をFmoc法(Applied Biosystem 433A)、逆相HPLC(WATERS; C18カラム)、大気圧イオン化法マススペクトル(Perkin-Elmer SCIEX APIII)を用い化学合成した。そのペプチドを用いGタンパク質(Gi_α-2 subunit, Myristoylated, Rat, Recombinant〕との相互作用を検討した。
合成ペプチドに10倍ずつ、4段階の濃度(1.7×10-3〜1.0×10-1[μM])とGタンパク質のサンプル溶液を混合し ニトロセルロースフィルタで濾過し Gタンパク質に取り込まれた[35S]GTPγSの計数を液体シンチレーションカウンタで測定した。受容体ペプチドを加えない溶液の測定値をコントロールとして計数比を求め、受容体ペプチドによるGタンパク質の活性化機能を測定した その結果このループペプチドとGタンパク質のモル比約1:1のとき、最大活性を得ることができた。

Research Products

• [Publications] Okuda, A., Matsumoto, O., Akaji, M., Taga, T., Ohkubo, T., Kobayashi, Y.: "Solution Structure of Intracellular Signal-Transducing Peplide Derived from Human β2-Adrenergic Receptor"Biochem.Biophys.Res.Comm.. 291. 1297-1301 (2002)