単一ミトコンドリアの時間分解計測による活性酸素発生抑制機構の研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13878131
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 太田 善浩 東京農工大学, 工学部, 助教授 (10223843)
• Keywords: ミトコンドリア / 活性酸素 / 膜透過性遷移 / 膜電位 / 蛍光イメージング

Research Abstract

【目的】ミトコンドリア活性の測定のほとんどは、懸濁液などのミトコンドリア集団を対象に行われてきた。個々のミトコンドリアごとに異なる振る舞いが生じている場合、集団を対象とした測定では、個々の振る舞いを平均した描像のみを捉えることになる。そこで、本研究ではミトコンドリア活性のうち膜電位を個々のミトコンドリアで測定し、その結果を老化や病気の原因となるミトコンドリアからの活性酸素の発生と比較・検討した。
【方法】豚心筋から単離したミトコンドリアをカバーガラスに吸着させ、膜電位感受性蛍光色素TMREで染色した。個々のミトコンドリアの膜電位は蛍光顕微鏡により、TMREの明るさから求めた。活性酸素の発生量は、生成される過酸化水素の量で評価した。
【結果・考察】
リンゴ酸を添加してNADHの生成を促進すると、個々のミトコンドリアは膜電位の急激な生成・消失を繰り返した。従来のミトコンドリア集団を対象とした測定では、ミトコンドリア膜は呼吸基質の添加後速やかに分極し、その後ほぼ一定の状態を保つため、ミトコンドリア集団での測定と大きく異なる結果である。次にこの膜電位の急激な変化が何によるものか検討した結果、膜電位が急激に変化する状態ではミトコンドリアから分子量600程度の親水性の蛍光色素(calcein)が流出することが確認され、急激な膜電位の消失は膜透過性遷移(PT)によって生じることがわかった。PTとはコンダクタンスの大きな非特異的チャネルが開くことによって生じると考えられている現象である。次に、活性酸素の発生量を比べると、繰り返し生じるPTによってミトコンドリアの電子伝達系が還元状態を回避できる状態では回避できない状態よりも、活性酸素の発生量が有意に抑制された。これらの結果は、ミトコンドリアでおきる一時的なPTは活性酸素の発生を抑制する機構であることを示唆するものである。

Research Products

• [Publications] Nakayama et al.: "Fluorescence Imaging of Metabolic Responses in Single Mitochondria"Biochim.Biophys.Res.Commun.. 290. 23-28 (2002)
• [Publications] Ohta, Y., Hattori, S.: "Determination of Membrane Potential in Single Mitochondria"BUTSURI. 57. 592-595 (2002)