蛋白質のN-末端特異的蛍光標識法の開発と生細胞内メチル化DNAの直接検出法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13878149
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 相本 三郎 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (80029967)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 末武 勲 大阪大学, 蛋白質研究所, 助手 (80304054) ; 川上 徹 大阪大学, 蛋白質研究所, 助手 (70273711) ; 田嶋 正二 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (50132931)
• Keywords: 末端アミノ基 / 選択的化学修飾反応 / N-末端特異的標識 / メチル化DNA結合ドメイン / 過ヨウ素酸ナトリウム / オキザロイル基

Research Abstract

発生・分化・情報伝達などの高次の生命現象を分子レベルの生命現象と結びつける手法を細胞生物学の領域の研究に提供することを目的として本研究を企画した.モデル実験系として、遺伝子の長期抑制や発癌などへの関与が指摘されているCpGメチル化を取り上げ,N-末端特異的蛍光標識メチル化DNA結合ドメインを調製し,これによって生細胞中のDNAのメチル化量とそのパターンを蛍光顕微鏡により直接観察し、ゲノムDNA中のメチル化量とその分布をどこまで評価することが可能か否かを検証することとした.
そのために、メチル化依存的転写リプレッサーのメチル化DNA結合ドメイン(MDBD)のアミノ末端部位に対応する一連のペプチドを化学合成し,そのアミノ末端にセリンを導入した.これらの標品を用いて過ヨウ素酸ナトリウムによるセリンのオキザロイル基への変換反応の条件検討をおこなった.その結果,反応を行う緩衝液のpHによって,ペプチド中のメチオニンやシステイン残基の酸化が起こること,質量分析データより,反応直後のペプチドは逆相のHPLCで精製しても過ヨウ素酸を付加しているらしいことが推察された.
今後さらにセリンの酸化条件を検討し、末端アミノ基への選択的化学修飾反応の最適化を行っていく予定である.