新規in vivo可視化技術を用いた真核細胞における遺伝情報発現機構の解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13GS0013
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 古久保 哲朗 横浜市立大学, 総合理学研究科, 教授 (10271587)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白川 昌宏 横浜市立大学, 総合理学研究科, 教授 (00202119)
• Keywords: 転写調節 / モニタリング / 遺伝子発現 / イメージング / NMR / MRI / ポリリン酸 / レポーター遺伝子

Research Abstract

すべての生命現象は必要な遺伝情報がプログラム通りに正しく発現することにより支えられている。遺伝子発現プログラムにおいて最も重要な制御段階は「転写」であり、その制御反応に関与する蛋白質の多くはすでに同定されたと考えられるが、それらの生体内における作用機構の詳細は依然として明らかではない。本研究の目的は、生物個体における遺伝子発現を非破壊的に計測する新規手法の開発を行い、その手法を用いて真核細胞の転写制御を支える分子的基盤及びその作動原理を明らかにすることである。
無機リン酸のポリマーであるポリリン酸は、全ての生物に普遍的に存在し、^<31>P-NMRによる定量的なマイクロイメージングが可能であることから、遺伝子発現量をモニターする上で非常に有効なプローブになりうるものと考えられる。近年出芽酵母においてポリリン酸の合成に必要な遺伝子が複数同定され、これらの遺伝子の変異株はポリリン酸を蓄積できないにもかかわらず正常に生育することが明らかにされた。そこで我々はこれらの変異株を宿主とし、ポリリン酸合成酵素を新規レポーター遺伝子として用いてプロモーター活性を効率よくモニタリングできる手法の開発を試みている。今年度は、発現オフのキネティックスを測定する上で最適と考えられるレポーター遺伝子の上流に基本転写因子TFIIDによって支配されるプロモーターを連結し、TFIIDの活性変化と細胞内ポリリン酸蓄積量の変化の相関について詳しい解析を行った。その結果、温度シフトによるTFIIDの失活に伴い、細胞内ポリリン酸蓄積量が有意に低下することを見出した。また今後このプロモーターアッセイ系を用いた解析をハイスループット化するために必要なコロニースポッターの開発を行った。

Research Products

• [Publications] S.Takahata, K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Autonomous function of the amino-terminal inhibitory domain of TAF1 in transcriptional regulation."Molecular and Cellular Biology. 24・8(in press). (2004)
• [Publications] A.Kobayashi, T.Kokubo, Y.Ota, S.Yokoyama: "Promoter-specific function of the TATA element in undifferentiated P19 cells."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 310・2. 458-463 (2003)
• [Publications] S.Takahata, H.Ryu, K.Ohtsuki, K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Identification of a novel TATA element-binding protein binding region at the N terminus of the Sacchaoomyces cerevisiae TAF1 protein."Journal of Biological Chemistry. 278・46. 45888-45902 (2003)
• [Publications] H.Ohdate, C.R.Lim, T.Kokubo, K-i.Matsubara, Y.Kimata, K.Kohno: "Impairment of the DNA-binding activity of the TATA-binding protein (TBP) renders the transcriptional function of Rvb2p/Tih2p, the yeast RuvB-like protein, essential for cell growth."Journal of Biological Chemistry. 278・17. 14647-14656 (2003)
• [Publications] A.Kobayashi, T.Miyake, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Mutations in the histone fold domain of the TAF12 gene show synthetic lethality with the TAF1 gene lacking the TAF N-terminal domain (TAND) by different mechanisms from those in the SPT15 gene encoding the TATA binding protein (TBP)."Nucleic Acids Research. 31・4. 1261-1274 (2003)
• [Publications] C.Auesukaree, T.Homma, H.Tochio, M.Shirakawa, Y.Kaneko, S.Harashima: "Intracellular phosphate serves as a signal for the regulation of the PHO pathway in Saccaromyces cerevisiae"Journal of Biological Chemistry. (in press). (2004)
• [Publications] K.Fujiwara, T.Tenno, K.Sugasawa, J.-G.Jee, I.Ohki, C.Kojima, H.Tochio, H.Hiroaki, F.Hanaoka, M.Shirakawa: "Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B"Journal of Biological Chemistry. 279・6. 4760-4767 (2004)
• [Publications] N.Goda, T.Tenno, H.Takasu, H.Hiroaki, M.Shirakawa: "The PRESAT-vector. Asymmetric T-vector for high throughput screening of soluble protein domains for structural proteomics"Protein Science. 13・3. 652-658 (2004)
• [Publications] Z.Kato, J.-G.Jee, H.Shikano, M.Mishima, I.Ohki, H.Ohnishi, A.Li, K.Hashimoto, E.Matsukuma, K.Omoya, Y.Yamamoto, T.Yoneda, T.Hara, N.Kondo, M.Shirakawa: "The structure and binding mode of interleukin-18"Nature Structural Biology. 10・11. 966-971 (2003)
• [Publications] M.Mishima, S.Takayama, K.Sasaki, J.-G.Pee, C.Kojima, A.Isogai, M.Shirakawa: "Structure of the male determinant factor for Brassica self-incompatibility"Journal of Biological Chemistry. 278・38. 36389-36395 (2003)
• [Publications] S.Watanabe, T.Ichimura, N.Fujita, S.Tsuruzoe, I.Ohki, M.Shirakawa, M.Kawasuji, M.Nakao: "Methylated DNA-binding domain 1 and methylpurine-DNA glycosylase link transcriptional repression and DNA repair in chromatin"Proceedings of National Academy of Sciences USA. 100・22. 12859-12864 (2003)