2014 Fiscal Year Annual Research Report
ウシの免疫抑制受容体の機能解析および難治性疾病の新規制御法への応用研究
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13J01442
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
岡川 朋弘 北海道大学, 獣医学研究科, 特別研究員(DC1)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 免疫抑制受容体 / PD-1 / LAG-3 / 疲弊化T細胞 / キメラ抗体 / 牛白血病 / ヨーネ病 / 難治性疾病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ウシの免疫抑制受容体PD-1やLAG-3に対する分子標的薬（キメラ抗体）を開発し、ウシ白血病ウイルス（BLV）感染症やヨーネ病をはじめとした難治性疾病に対する新規制御法を樹立することを目的としている。
まず、昨年度樹立した抗ウシPD-1ラット-ウシキメラ抗体発現細胞株（CHO DG44細胞株）について、メトトレキサートを用いた遺伝子増幅処理を行い、発現細胞に導入した遺伝子カセットのコピー数増幅を試みた。現時点で、91.7 mg/Lの抗PD-1キメラ抗体を産生する安定発現細胞を樹立した。また、Expi293F細胞による一過性発現系も導入し、224.3 mg/Lの抗PD-1キメラ抗体を産生させることに成功した。
次に、昨年度樹立した抗ウシLAG-3ラットモノクローナル抗体の可変領域遺伝子を同定し、ウシIgG1の定常領域遺伝子と組み合わせて、抗ウシLAG-3ラット-ウシキメラ抗体の発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを哺乳類細胞株CHO DG44へ導入した後、2,688ウェル分の発現細胞を作製し、この中から目的のキメラ抗体を高産生するクローンを10種類選抜した。これまでに8.85 mg/Lの抗LAG-3キメラ抗体を産生する安定発現細胞を得た。
さらに、ウシPD-1発現細胞およびウシLAG-3発現細胞に対する各キメラ抗体の結合性をフローサイトメトリー法にて検討した。その結果、いずれのキメラ抗体もラットモノクローナル抗体と同様に細胞膜上のPD-1またはLAG-3を認識した。次に、BLV感染牛のT細胞に対する再活性化効果を検討した。抗PD-1キメラ抗体は一部の感染牛でT細胞からのIFN-gamma産生を再活性化し、B細胞におけるBLVウイルスタンパク質の産生を阻害した。一方、抗LAG-3キメラ抗体はほとんどの感染牛でT細胞からのIFN-gamma産生を再活性化した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初の年度計画にあった通り、抗ウシPD-1ならびにLAG-3ラット-ウシキメラ抗体の作製を進め、抗PD-1キメラ抗体については、平成27年度に予定しているウシを用いた臨床試験に必要なキメラ抗体を作製することに成功した。抗LAG-3キメラ抗体の樹立については平成26～27年度にかけて2年間で行う計画であったが、現時点では当初の計画通りPD-1に追随する形で発現細胞株の樹立を進めている。
また、今年度は作製したキメラ抗体を用いて機能試験を行い、in vitroでの生物活性を示した。2種類のキメラ抗体は想定通りそれぞれウシPD-1とLAG-3へ結合し、BLV感染牛のT細胞を再活性化した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、抗PD-1, LAG-3キメラ抗体の安定発現細胞（CHO DG44細胞）の産生量をさらに増加させるため、これらの細胞株に対してメトトレキサートを用いた遺伝子増幅処理を継続する予定である。順調に進めば、平成27年度中に最終的な目標産生量（1-2g/L）の発現細胞株が樹立できる見込みである。
また、安定発現系（CHO DG44細胞）、および一過性発現系（Expi293F細胞）のいずれについても、培養のスケールアップを行い、0.5-1gのキメラ抗体を生産する。その際には、大量の培養上清からの抗体精製が可能なバッチ法による精製を試みる。
そして、これらの発現系で作製したキメラ抗体について、BLV感染牛を用いた臨床試験を行なう。キメラ抗体を投与した前後で、ウシのT細胞応答や抗BLV効果の変化や、キメラ抗体の血中半減期をモニタリングし、キメラ抗体の生体内での効果を検討する。また、試験牛の全身状態の観察とバイタルサイン（体温・心拍数・呼吸数）の測定を行い、キメラ抗体の投与による副作用の有無（安全性）を確かめる。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Expression of PD-L1 on Canine Tumor Cells and Enhancement of IFN-γ Production from Tumor-Infiltrating Cells by PD-L1 Blockade2014
Author(s)
Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e98415
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] A novel strategy for immunotherapy of paratuberculosis in cattle: regulation of T-cell response to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis by the blockade of immunoinhibitory receptors2015
Author(s)
Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Mizorogi S, Ikebuchi R, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Mori Y, Murata S, Ohashi K
Organizer
Keystone Symposia on Immunity to Veterinary Pathogens: Informing Vaccine Development
Place of Presentation
Keystone, USA
Year and Date
2015-01-21
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[Presentation] ウシの免疫抑制受容体を介したヨーネ菌特異的T細胞応答の疲弊化2014
Author(s)
岡川朋弘, 今内覚, 池渕良洋, 西森朝美, 溝呂木聖子, 永田礼子, 川治聡子, 田中省吾, 森康行, 村田史郎, 大橋和彦
Organizer
第157回日本獣医学会学術集会
Place of Presentation
北海道札幌市
Year and Date
2014-09-11
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