2013 Fiscal Year Annual Research Report
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13J06543
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤川 芳宏 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | 損傷乗り越えDNA合成 / メダカ / Rev1 / TALENs |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、変異体メダカを用いたRev1の遺伝子機能解析である。損傷乗り越えDNA (Translesion DNA Synthesis : TLS)ポリメラーゼは、DNA損傷に対して誤りがちな塩基を挿入することでDNA複製を進行させる。そのためTLSは突然変異を引き起こし、ひいては発がんに関与すると考えられている。Rev1はTLSポリメラーゼの1つであり、鋳型塩基に対してシトシンを取り込むdCMP転移活性を持つ。一方でRev1は、他のTLSポリメラーゼと異なり、C末端側に他のTLSポリメラーゼと相互作用するユニークな領域を持つ。Rev1はこの領域を介して他のTLSポリメラーゼと複合体を形成する足場タンパクの役割を持つと考えられている。しかし、この複合体の役割はまだ十分に明らかになっていない。そこで私は組織・個体レベルの遺伝学的解析に有利なモデル生物であるメダカを用いて、Rev1遺伝子の機能解析を行った。
今年度はまず、当研究室で作製した3種類のRev1変異体メダカ(dCMP転移活性ミスセンス変異体、C末側相互作用領域変異体、N末側ナンセンス変異体)の解析を分子レベルで行い、研究に利用できる変異体であることを確かめた。次に発がん実験によって個体レベルでの解析を行った。その結果、Rev1のC末端相互作用領域はアルキル化剤(DENA)感受性及び発がんに重要である事が判った。これは現在報告されているRev1の紫外線感受性と比べて異なる結果であった。また、相互作用ドメイン解析のために、人工ヌクレアーゼ(TALENs)を用いて他のTLSポリメラーゼ変異体メダカの作製を試みた。現在のところ、Polζ(Rev3とRev2の複合体), Polη, Polκはヘテロ欠失の個体が作製できておりPoll, Polγ, Polθ変異体に関してはスクリーニング中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は変異体メダカを用いて、Rev1のC末端相互作用領域が化学変異原における感受性及び発がんに重要である事を明らかにした。これは現在報告されている紫外線感受性と比べて異なる結果であり、興味深い。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。しかし、個体レベルの結果を裏付けるための細胞レベルの解析が遅れている。各変異体由来の培養細胞の作製を試みたが、dCMP転移活性ミスセンス変異体の培養細胞のみ樹立できなかったからである。また、Rev1以外のTLSポリメラーゼ変異体の作製が遅れているため、Rev1との二重変異体の作製に至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は細胞レベルでの解析のために、まずdCMP転移活性ミスセンス変異体の培養細胞を樹立する。初期胚からでは安定して増殖する細胞が得られなかったため、新たに鰭から培養細胞の樹立を試みる。次にRev1が引き起こす発がんのメカニズムを明らかにするために次世代シーケンサーを用いてゲノムの塩基配列を網羅的に決定し変異スペクトラムを解析する。また、発がん実験の結果を裏付けるために、BACを用いたRev1のトランスジェニック個体を作製し、rescue実験を行う。そして、得られた他のTLSポリメラーゼ変異体とRev1変異体の二重変異体を作製し、発がん実験を行う。
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Research Products
(5 results)
