十脚甲殻類の浸透圧調節に関与する未知タンパク質の探索と機能解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J08421
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 進士 淳平 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2013-04-26 – 2016-03-31
• Keywords: 甲殻類 / 浸透圧調節 / アミノ酸 / 代謝

Outline of Annual Research Achievements

初年度に行ったタンパクのスクリーニングの結果、筋肉において環境塩分の低下に伴い解糖系の酵素であるエノラーゼの含有量が著しく減少することが明らかとなった。解糖系は、細胞呼吸により炭水化物からエネルギーを作るためのメカニズムである。このことから、低塩分下では炭水化物をエネルギー利用するための代謝経路が強く抑制され、エネルギー源が別のものにシフトしたと考えられる。
この低塩分下で抑制される代謝経路の代わりに活性化する代謝経路として、申請者はアミノ酸代謝に着目した。十脚甲殻類では、呼吸・排泄速度の比較に基づき、低塩分下においてアミノ酸などの窒素化合物を主要なエネルギー源として用いることが示唆されている。そこで本研究では、次にアミノ酸をエネルギー利用するための代謝経路の体系的な解析に取り組むこととした。
研究開始2年目にあたる平成26年度は、上述の研究背景からアミノ酸代謝およびクエン酸回路関連酵素遺伝子の分析を行う傍ら、平成25年度の研究の継続として、浸透圧調節に関連した基礎生理指標の分析を行った。血液浸透圧および筋肉中水分含量の分析を行った結果、血液の浸透圧は環境浸透圧の減少とほぼ同様の減少パターンを示したのに対し、筋肉中の水分含量は変化しなかった。また、筋肉の組織観察を行った結果、対照区に対し-10 pptの塩分変化に対し、筋肉の組織形状は維持されていた。これらの結果は、環境塩分に応じて血液浸透圧が減少しても、何らかの生理機構の働きによって組織は吸水せず、細胞の形状が維持されたことを示唆していた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度に行ったタンパクのスクリーニングの結果、筋肉において環境塩分の低下に伴い解糖系の酵素であるエノラーゼの含有量が著しく減少することが明らかとなった。解糖系は、細胞呼吸により炭水化物からエネルギーを作るためのメカニズムである。このことから、低塩分下では炭水化物をエネルギー利用するための代謝経路が強く抑制され、エネルギー源が別のものにシフトしたと考えられる。
この低塩分下で抑制される代謝経路の代わりに活性化する代謝経路として、申請者はアミノ酸代謝に着目した。十脚甲殻類では、呼吸・排泄速度の比較に基づき、低塩分下においてアミノ酸などの窒素化合物を主要なエネルギー源として用いることが示唆されている。そこで本研究では、次にアミノ酸をエネルギー利用するための代謝経路の体系的な解析に取り組むこととした。
研究開始2年目にあたる平成26年度は、上述の研究背景からアミノ酸代謝およびクエン酸回路関連酵素遺伝子の分析を行う傍ら、平成25年度の研究の継続として、浸透圧調節に関連した基礎生理指標の分析を行った。血液浸透圧および筋肉中水分含量の分析を行った結果、血液の浸透圧は環境浸透圧の減少とほぼ同様の減少パターンを示したのに対し、筋肉中の水分含量は変化しなかった。また、筋肉の組織観察を行った結果、対照区と比較して-10 pptの塩分低下に対し、筋肉の組織形状は維持されていた。これらの結果は、環境塩分に応じて血液浸透圧が減少しても、何らかの生理機構の働きによって組織は吸水せず、細胞の形状が維持されたことを示唆していた。

Strategy for Future Research Activity

ここまでの研究で、甲殻類の低塩分下の細胞レベルの浸透圧調節にアミノ酸代謝に関わる酵素が関与していることが示唆された。こうした酵素は、浸透圧を構成する物質としてのアミノ酸の含有量を調節するため、低塩分下で不要なアミノ酸をエネルギー利用し、細胞浸透圧を下げる働きをすると考えられる。
そこで、最終年度にあたる3年目は、この仮説をより確かなものとするため、まずHPLCと市販キットを用いて代謝産物の網羅的な測定を行う予定である。これにより実際に組織中のアミノ酸動態が各アミノ酸代謝酵素の発現動態と一致することが明らかになれば、低塩分順応過程でアミノ酸量を調節するために特定のアミノ酸代謝経路が機能した強い証拠となる。
次に、ここまでの実験で低塩分順応に機能することが示唆されたアミノ酸代謝酵素の遺伝子ノックダウン実験を行う。各アミノ酸代謝酵素の部分配列に相補的な二本鎖RNAを作成し、実験動物に投与する。これにより標的遺伝子の発現を人為的に抑制し、その上で環境塩分を低下させる。もし標的遺伝子が低塩分順応に機能するのであれば、この操作により実験動物が低塩分に順応できず死亡するか、抑制されたアミノ酸代謝経路を代替する他のアミノ酸代謝経路が活性化すると予想される。これにより、各アミノ酸代謝酵素が担う代謝経路が低塩分順応に機能するか明らかにする。
以上の実験により、環境塩分の変化に順応するためのエネルギー代謝経路とそれを利用した浸透圧調節機構が明らかにされることが期待される。