分解制御可能な人工ポリユビキチンの創製と細胞内機能解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J08872
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 奥 彰彦 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ユビキチン / 細胞内タンパク質 / カルモジュリン / リポソーム

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、申請書年次計画に記した中で、人工タンパク質の効率的な細胞内導入法の開発に重点をおいた研究を行った。多量体の人工ポリユビキチンを細胞内に導入するためには、CPPに比べより効率的な導入法を見出すことが必要であると考えられる。そこで本研究では、リポソームを用いた細胞内導入に着目した。細胞と融合するリポソームは、内部に封入した物質を細胞内に移行させることができる。今後、時空間的に脱ユビキチン化を制御できるようなポリユビキチンを導入することを目的としているため、このリポソームによる細胞内導入もやはり特定の外部刺激によりその融合を制御できることが重要であると考えられる。そこで、カルシウムイオン依存性タンパク質であるカルモジュリンに由来するペプチドを用いてリポソームを修飾することを目的に研究を行った。
昨年までの研究において、カルモジュリンのN末端から3番目と4番目のモチーフであるHLH3とHLH4が、cholesterolによりペプチドが膜に挿入され、リポソーム表面に提示されることを目的に、これらペプチドのN末端に、スペーサーであるPEG12、そしてcholesterolを結合させたペプチドを調製した。本年度の研究において、リポソーム膜上に導入した蛍光色素のエネルギー移動(FRET)の解消を指標に膜融合効率を評価したところ、HLH3とHLH4とを提示したリポソームを混合した際には、カルシウムの添加によりFRETの解消が見られたが、ペプチドを提示していないリポソームではFRETの解消は見られなかった。また、蛍光色素であるANTSと消光剤であるDPXをそれぞれ内包したリポソームを用いて水溶性コンパートメントの混合効率を評価したところ、HLH3とHLH4とを提示したリポソームを混合した際にのみ、カルシウムの添加により顕著にANTSの消光が観察された。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。