一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14011203
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 桑原 正靖 群馬大学, 工学部, 助手 (40334130)
• Keywords: 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー / 生体生命情報学 / 有機化学

Research Abstract

1)「種々の修飾ヌクレオシド三リン酸の合成と修飾DNAのPCRによる酵素的合成」
本年度の研究において、アミノ酸をリンカー末端に導入した種々の修飾チミジン三リン酸や5位に1-アミノ-3,6-ジオキサヘプチル基修飾デオキシウリジン三リン酸(修飾dUTP)を新規に合成した。さらに、核酸塩基が異なる修飾デオキシシチジン三リン酸(修飾dCTP)も合成した。これらの修飾ヌクレオシド三リン酸が耐熱性DNAポリメラーゼに基質として認識され、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって対応する修飾DNAが生成することを明らかにした。^<(1)>興味深いことに、天然型のdCTPとTTPの代わりに修飾dCTPと修飾dUTPを用いてPCRを行った結果、両方の修飾ヌクレオチドが導入された修飾DNAの生成が確認された。これは二種類の異なる機能基をもつ修飾DNAが酵素的に合成できることを示唆している。^<(2)>一方、修飾ヌクレオシド三リン酸を基質として認識する耐熱性DNAポリメラーゼの探索も行った。その結果、KOD Dashの他にvent(exo-)やPfuがチミジンの5位への修飾に寛容であることが新たにわかった。^<(3)>以上(1)(2)(3)に述べたように、修飾DNAの酵素的合成に適用可能な修飾ヌクレオシド三リン酸のレパートリーを大幅に拡張することができた。
2)「試験管内選択系の確立と機能評価」
55塩基のランダム配列の両端にそれぞれ20塩基のプライマー配列を含む95塩基長の天然型DNAを基に1.9×10^<13>通りの配列を含む一本鎖のアミノ修飾DNAライブラリーを調製した。修飾ヌクレオシド三リン酸にはアミノヘキシルカルバミルメチル修飾デオキシウリジン三リン酸を用いた。調製した修飾DNAライブラリー中から、シングルミスマッチ構造を含む二重鎖DNAに特異的に結合する修飾DNAを選択する操作を現在進行中である。