急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14011210
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 片山 栄作 東京大学, 医科学研究所, 教授 (50111505)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 馬場 則男 工学院大学, 工学部, 教授 (80164896)
• Keywords: 急速凍結

Research Abstract

われわれは、急速凍結フリーズ・レプリカ電子顕微鏡の特長を利用して、溶液内あるいは細胞内で機能遂行中の1個1個の蛋白質の一瞬の姿を捉え、その立体構造を精密に解析する一連の手法の開発と応用を進めている。具体的方法として、レプリカ像からの3次元再構成、そして原子構造既知の蛋白質やその複合体に想定されるレプリカ像のコンピュータ・シミュレーションを行ってきた。
本年度は、in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体試料中でしばしば観察され、アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲することが知られ、そのX線結晶構造が発表されている。またミオシンATPaseのさまざまな反応中間体アナログを形成する金属イオン/ADP複合体でも類似の構造を取ると考えられている。しかし、これらの構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しなかった。そこで、不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉え、その3次元構造を解析したところ、滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方、pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され、ADP結合ミオシンに近いと結論されているが、その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1、SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが、ホタテ貝ミオシンではSH-2とリジンが架橋されることが分かっている、これらのことから種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。

Research Products

• [Publications] H.Tanaka: "The motor domain, not a long neck domain, determines the large step of myosin-V"Nature. 415. 192-195 (2002)
• [Publications] S.Nishikawa: "Class VI myosin moves processively along actin filaments backward with large steps"Biochemical and Biophysical Research Communications. 290. 311-317 (2002)
• [Publications] K.Tamano: "Shigella Spa32 is an essential secretory protein for functional type III secretion machinery and uniformity of its needle length"Journal of Bacteriology. 184. 1244-1252 (2002)
• [Publications] M.Tominaga: "Oiwa Higher plant myosin XI moves processively on actin with 35 nm steps at high velocity"EMBO Journal. (印刷中). (2003)
• [Publications] M.Fukuda: "The calcium-binding loops of the tandem C2 domains of synaptotagmin VII cooperatively mediate calcium-dependent oligomerization"Journal of Biological Chemistry. 277. 29315-29320 (2002)
• [Publications] S.Yoshida: "Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization, which promoted Rac1 activity and efficient bacterial internalization"EMBO Journal. 21. 2923-2935 (2002)