Pol III発現系を用いた哺乳動物細胞におけるRNA干渉の開発とガン治療への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14030011
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 多比良 和誠 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (10261778)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮岸 真 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (30323538)
• Keywords: RNA interference / pol III系 / U6プロモーター / 遺伝子治療 / がん遺伝子 / RNAiライブラリー

Research Abstract

本年度は、がんのsiRNA発現ライブラリーを用いた網羅的な研究を見据え、siRNA発現ベクターライブラリー作製法の検討を行った。具体的には、ライブラリーの作製に必要となるいくつかの課題に取り組んだ。まず、siRNAを効率的に、安価に作成する手法の検討を行った。その結果、インサートDNAを混合して、クローニング後にクローンを選別する方法を開発し、月3000個から5000個のsiRNAベクターを作製することが可能となった。次に、siRNAの効果のターゲットサイト依存性が最もクリティカルな問題であったので、レポーター遺伝子に対して、数百個のsiRNAを合成し、その遺伝子抑制活性のデーターを解析し、高いターゲットサイトを選別するアルゴリズムの開発を行った。その結果、非常に高い確率で効果の高いターゲットサイトを選択することが可能となり、実質的に質の高いライブラリーの作製が可能となった。また、siRNAの特異性の問題に関しても検討を行い、siRNA Blastと呼ばれるsiRNAの特性性を評価するプログラムを作製した。これによって、複数のターゲットを壊してしまう可能性のあるsiRNA発現ベクターをライブラリーから除外することが可能となった。これらの検討をもとに、アポトシスに関与する遺伝子数300個に対して、siRNA発現ベクターライブラリーを作製し、その評価を行っている。ごく最近の結果では、いくつかのアポトシスのシグナルにおいて、既に知られている遺伝子と共に、まだ、関与することが知られていない遺伝子が次々と明らかになっており、siRNA発現ライブラリーを用いた遺伝子探索が非常に有効であることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Yoshinari, K, Miyagishi, M, Taira, K: "Effects on RNAi of structure, sequence and position within target RNA and potentially preferable sequence motif for siRNA activities in mammalian cells : Sequence itself rather than its location determines siRNA efficacy."Nucleic Acids Res.. 31. 691-666 (2004)
• [Publications] Taki, M., Kato, Y., Miyagishi, M., Takagi, Y., Taira, K.: "Small Interfering RNA Expression in Cells Based on an Efficiently Constructed Dumbbell-shaped DNA."Angew.Chem.Int.Ed.Engl.. (in press). (2004)
• [Publications] Miyagishi, M., Suminoto, H., Miyoshi, H., Kawakami, Y., Taira, K.: "Optimization of an siRNA-expression system with a mutated hairpin and its significant suppressive effects upon HIV vector-mediated transfer into mammalian cells."J.Gene Med.. (in press). (2004)
• [Publications] Miyagishi, M, Taira, K: "Strategies for generation of a stable siRNA-expression library directed against the human genome."Oligonucleotides. 13. 325-333 (2003)
• [Publications] Yokota, T., Sakamoto, N., Enomoto, N., Tanabe, Y., Miyagishi, M., Maekawa, S., Yi, L, Kurosaki, M., Taira, K., Watanabe, M., Mizusawa, H.: "Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived small interfering RNAs."EMBO Rep.. 4. 602-628 (2003)
• [Publications] Onuki, R., Bando, Y., Suyama, E., Katayama, T., Kawasaki, H., Baba, T., Tohyama, M., Taira, K.: "Involvement of an RNA-dependent protein kinase(PKR) in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease."EMBO J.. 23. 959-968 (2003)
• [Publications] Miyagishi, M., Matsumoto, S., Futami, T., Akashi, H., Appasani, K., Takagi, Y., Sutou, S., Taira, K.: "In "RNAi technology", Appasani, K.(ed.), Cambridge University Press, Cambridge, UK."Generation of highly specific shRNAi expression libraries against entire human genome.(in press). (2004)