RNAi酵素複合体の実体解明と分子機能解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14035212
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 善野 修平 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90313204)
• Keywords: RNAi / siRNA / 二本鎖RNA / Dicer / eIF2C / RISC

Research Abstract

平成14年度は、ヒトとマウスのRNAi関連PAZ蛋白質(Dicer, EIF2C)のcDNAクローニングを行なった。ゲノムのドラフト配列と完全長cDNA、ESTクローンの5'末端配列、コザック配列、5'-非翻訳領域のインフレーム終止コドンから、開始コドンを推定してRT-PCRプライマーを設計し、完全なコード領域を含むcDNA断片を得た。dicer遺伝子はヒト、マウスゲノム中に1コピーのみで(ヒトゲノム14q32,マウス12E)、一方eIF2Cは4コピー存在した。eIF2C2はヒトでゲノム8q24+3に、マウスで15D3に位置し、残りの3つはeIF2C4, eIF2C1, eIF2C3の順番でタンデムに連なっていた(ヒトゲノム1P34+2,マウス4D2+2)。ヒトとマウスのcounterparts同士はアミノ酸配列にして2%以内の相違が存在するのみであったが、EIF2C1-4のPAZドメインの上流に、新たな保存領域(PRPモチーフと命名)を見い出した。このPRPモチーフはRNAi関連蛋白質である線虫Rde-1、ハエAgo2には存在しないものの、カビQde2、線虫Alg-1, Alg-2には存在した。もしかすると、これはmiRNA活性に必要なモチーフかもしれない。次に、培養細胞系を用いてdicer、eIF2C1-4のsiRNA-RNAi効果への関与を調べたところ、dicerやeIF2C1-4をsiRNAでノックダウンした場合、siRNA-RNAi活性が弱められた。さらに、免疫沈降試験から、DicerとeIF2C1, 2が相互作用しえることを突き止めた。これらの知見は、哺乳類のDicerとeIF2C群がRISC成分として機能し、siRNA生成後のRNAi機構に関与することを示すものである。

Research Products

• [Publications] Masahiro Sakurai: "Identification of possible substrate-specificity determinants in NfsA, the major oxygen-insensitive nitroreductase from Escherichia coli"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Woo Cheol Lee: "Crystallographic analysis of flavin oxidoreductase from Helicobacter pylori responsible for its susceptibility to antibiotic metronidazole"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Noboru Doi: "Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors"Current Biology. 13・1. 41-46 (2003)
• [Publications] 程久美子: "哺乳類培養細胞でのsiRNAによるRNAiプロトコル"細胞工学. 21・9. 1058-1061 (2002)
• [Publications] 上田龍: "ショウジョウバエのRNAiプロトコル(誘導型RNAi)"細胞工学. 21・8. 931-940 (2002)
• [Publications] 程久美子: "RNAi法による逆遺伝学、新タンパク質科学実験法"大島泰郎・藤井義明・村松・喬 編、東京化学同人(印刷中). (2003)