ヘパラン硫酸糖鎖による形態形成の時空間的調節

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14082206
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 木全 弘治 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 教授 (10022641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 羽渕 弘子 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 講師 (90329821) ; 羽渕 脩躬 愛知教育大学, 教育学部, 教授 (90024067)
• Keywords: ヘパラン硫酸 / 細胞増殖因子 / 形態形成因子(モルフォゲン) / 濃度勾配 / コンドロイチン硫酸 / プロテオグリカン / グリコサミノグリカン / 遺伝子欠損マウス

Research Abstract

細胞増殖因子や形態形成因子とヘパラン硫酸鎖(HS)中のO-硫酸基による特異構造部位との複合体形成反応は、組織形態形成に重要なこれらの因子の活性調節と濃度勾配形成に不可欠であると仮定し、HSのO-硫酸転移酵素の発現変化によるHS鎖の構造異常を誘起して組織の形態や機能異常から証明する。
実験系I(マウスの系):HS2-O-と6-O-硫酸転移酵素群について、遺伝子欠損マウスの作製に成功した。HS6ST-1については胎児期に胎盤脈絡膜形成と肺胞形成不全により95%以上が致死に到る。HS6ST-2については大きな形態的機能的な異常はない。HS組成分析からは、前者マウスではHS中のモノ、ジ硫酸化残基含量の胎盤、肺、腎臓、肝における著しい、後者では脾臓における著しい含量低下を確認した。しかし両マウスともトリ硫酸化残基の含量低下は少なく、また逆にIdoA(2S)残基の増加を観察した。遺伝子欠損マウスにおける胎盤脈絡膜形成不全はWnt2からVEGFの、また肺胞形成不全はWnt5bのシグナル異常による可能性を解析している。
実験系II(ニワトリ胚肢芽の系):HSのO-硫酸転移酵素群の肢芽における発現を部位特異的に変化させるため、従来のレトロウイルス遺伝子導入法に代わってエレクトロポーレション法を確立した。プロウイルスRCAS-DNAを導入し感染させる方法を採用したが、GFP発現でみる限り期待に反した。CMV-DNAを導入する方法がむしろ高効率の発現を得て、現在、センス方向発現で過剰発現を、アンチセンス方向発現で抑制効果を試行し、肢芽形態の異常を観察した。より明確な抑制結果を期待してsiRNAの導入を試みている。
実験系III(ショウジョウバエの系):HS2-O-硫酸転移酵素(HS2ST)と3-O-硫酸転移酵素(HS3ST)のノックアウト株を、トランスポゾンを利用して作製に成功し、異常の解析を開始した。
分担研究として、コンドロチン硫酸鎖(CS)についても特にジ、トリ硫酸化部位は因子特異性は異なるが同様な活性を示し、GalNAc4S-6STがCSの非還元末端に特異なトリ硫酸化構造合成に関与することを示した。
さらに疎水性アグリコンをもつ硫酸化糖グリコシドがHSとCSの硫酸転移酵素の阻害剤になることを見出し、両系において薬剤による糖鎖構造修飾の可能性が出てきた。

Research Products

• [Publications] T.Sato, M.Gotoh, et al.: "Differential roles of two N-acetylgalactosaminyltransferases, CSGalNAcT-1,and a novel enzyme, CSGalNAcT-2."J Biol Chem. 278. 3063-3071 (2003)
• [Publications] H.Habuchi, G.Miyake, et al.: "Biosynthesis of heparan sulphate with diverse structures and functions : two alternatively spliced forms of human heparan sulphate 6-O-sulphotransferase-2 having different expression patterns and properties."Biochem J. 371. 131-142 (2003)
• [Publications] E.Smeds, H.Habuchi, et al.: "Substrate specificities of mouse heparan sulphate glucosaminyl 6-O-sulphotransferases."Biochem J. 372. 371-380 (2003)
• [Publications] P.Jemth, E.Smeds, et al.: "Oligosaccharide library-based assessment of heparan sulfate 6-O-sulfotransferase substrate specificity."J Biol Chem. 278. 24371-24376 (2003)
• [Publications] K.Yamagishi, K.Suzuki, et al.: "Purification, characterization, and molecular cloning of a novel keratan sulfate hydrolase, endo-β-N-acetylglucosaminidase, from Bacillus circulans."J Biol Chem. 278. 25766-25772 (2003)
• [Publications] H.Mochizuki, K.Yoshida, et al.: "Characterization of a heparan sulfate 3-O-sulfotransferase-5,an enzyme synthesizing a tetrasulfated disaccharide."J Biol Chem. 278. 26780-26787 (2003)
• [Publications] T.Yada, M.Gotoh, et al.: "Chondroitin sulfate synthase-2."J Biol Chem. 278. 30235-30247 (2003)
• [Publications] R.J.Bink, H.Habuchi, et al.: "Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase is essential for muscle development in zebrafish."J Biol Chem. 278. 31118-31127 (2003)
• [Publications] S.Ohtake, K.Kimata, et al.: "A unique nonreducing terminal modification of chondroitin sulfate by N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-sulfotransferase."J Biol Chem. 278. 38443-38452 (2003)
• [Publications] A.Irie, H.Habuchi, et al.: "Heparan sulfate is required for bone morphogenetic protein-7 signaling."Biochem Biophys Res Commun. 308. 858-865 (2003)
• [Publications] T.Yada, T.Sato, et al.: "Chondroitin sulfate synthase-3."J Biol Chem. 278. 39711-39725 (2003)
• [Publications] T.Okuda, T.Sawada, et al.: "Mouse N-acetylgalactosamine 4-sulfotransferases-1 and -2. Molecular cloning, expression, chromosomal mapping and detection of their activity with GalNAcbeta1-4GlcNAcbeta1-octyl."J Biochem (Tokyo). 134. 111-120 (2003)
• [Publications] K.Nogami, H.Suzuki, et al.: "Distinctive expression patterns of heparan sulfate O-sulfotransferases and regional differences in heparan sulfate structure in chick limb buds."J Biol Chem. 279. 8219-8229 (2004)
• [Publications] S.Ashikari-Hada, H.Habuchi, et al.: "Characterization of Growth Factor-binding Structures in Heparin/Heparan Sulfate Using an Octasaccharide Library."J Biol Chem. 279. 12346-12354 (2004)
• [Publications] S.Takeo, M.Fujise, et al.: "In vivo hyaluronan synthesis by expression of mammalian hyaluronan synthase gene in drosophila."J Biol Chem. (In press). (2004)
• [Publications] 羽渕脩躬, 羽渕弘子, 木全弘治: "プロテオグリカン硫酸化に働く硫酸転移酵素の分子的多様性と生物機能"蛋白質 核酸 酵素. 48. 1010-1018 (2003)
• [Publications] T.Yada, N.Koide, et al.: "Extracellular Matrix and the Liver. Chapter 4 Functions of proteoglycan/glycosaminoglycan in liver."Elsevier Science. 55-74 (2003)