2005 Fiscal Year Annual Research Report
生体細胞の凍結過程におけるミクロ熱・物質移動の能動的促進と活性評価法の確立
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14205033
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
棚澤 一郎 日本大学, 工学部, 客員研究員 (30013105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾股 定夫 日本大学, 工学部, 教授 (90060186)
白樫 了 東京大学, 生産技術研究所, 助教授 (80292754)
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| Keywords | 医用生体工学 / 生体細胞凍結保存 / 凍害防御剤 / 活性評価法 / 生体熱・物質移動 / 能動的物質移動制御 / 電場利用 / 柔らかさ計測 |
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| Research Abstract |
生体組織の凍結保存を成功させるには、凍結時に細胞の内外に生成する氷晶による致命的な損傷(凍害)を抑止する必要がある。そのため、凍結過程での冷却速度を最適に制御すると同時に、凍害防御剤の適切な選定によって氷核の生成・成長を抑制することが行われている。凍結保存の一連の過程を通じて、細胞の生存を支配する現象には、(1)浸透圧ストレス(細胞の過膨張、過収縮)、(2)細胞内凍結、(3)細胞外で生成した氷晶による力学的ストレス、(4)生化学的毒性、などがある。理想的な凍害防御剤とは、これらすべてを回避できる能力をもつものと考えられる。
本研究の第一の目的は、上記(1)〜(4)を回避しうる凍害防御剤を選定し、さらに電場などを用いた能動的方法によって、高濃度の凍害防御剤を速やかに細胞内に取り込み、緩慢冷却速度でのガラス化(非晶質状態での固化)を実現して、上記(2)の凍害を抑止することである。
第二の目的は、凍結過程および凍結後の細胞の活性評価法(viability assessment)の確立である。本研究では超音波を用いた組織・細胞の力学的特性の計測や、蛍光反応を利用した細胞内のアデノシン3りん酸(ATP)の定量などを試みた。これら2テーマに関する本年度の研究成果の概略は以下のとおりである
テーマ1について:上に述べた諸条件を満足する凍害防御剤を見つける目的で、これまで使用してきたグリセロール、ジメチルスルフォキシド(DMSO)に加えてアルギン酸、トレハロースおよびこれらの混合物について実験を行った。試料細胞としては、取り扱いが容易であることから主としてヒト由来の浮遊細胞を用いた。実験の結果、アルギン酸は低濃度で高粘性であるため、細胞膜の形状を維持する機能があること、トレハロースは細胞外に微細な氷晶をつくり、細胞内に取り込まれなくても細胞内凍結を抑制する効果をもつことなどがわかった。なお、電場印加による高濃度凍害防御剤の細胞内導入についての実験も行い、ある程度満足すべき成果を得たが、印加の最適条件を明らかにするには至たっていない。
テーマ2について:微小な生体組織の「柔らかさ」を測定することによる活性評価を目標とする、超音波パルス法による軟組織の力学的測定法を開発した。また、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光の測定により、細胞内のATP量を測定して、細胞の生存率を求める方法を開発した。
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Research Products
(6 results)
