2002 Fiscal Year Annual Research Report
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14208081
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三木 邦夫 京都大学, 大学院・理学研究科, 教授 (10116105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
喜多 昭子 京都大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70273430)
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| Keywords | 光回復酵素 / 体内時計 / CRY / 結晶化 / X線回析実験 / DNAグリコシラーゼ / 塩基除去修復 / Neil1 |
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| Research Abstract |
本研究は光回復酵素などのDNA修復酵素と密接な関係にあるタンパク質の結晶構造を決定し,その構造と機能の関係を解明することを目的とする.
日周リズム調節に関与する光回復酵素遺伝子ホモローグであるCRY(Cryptochrome)タンパク質は光回復酵素ファミリーに属しているが,修復活性は持たず、動物の体内時計を制御する因子の一つとして機能している.光回復酵素ファミリーのタンパク質は,光受容およびそのエネルギー転化のために2つの補欠因子(FADと第二クロモフォア)を持っている.ショウジョウバエCRY(dCRY),マウスCRY1およびCRY2について,pETシステムを用いた大腸菌発現系の構築を試みた.いずれのタンパク質も発現量が少なかったため,培養温度,発現誘導条件を改良して,N末端側にヒスチジンTagをつけたdCRYについて高発現する条件を見出した.CRYタンパク質の大量発現には,第二クロモフォアの前駆体である葉酸を添加し,さらに培養温度を制御して大腸菌内のシャペロンタンパク質を効果的に誘導することが必要であることがわかった.その結果,大量発現させた組換えタンパク質の精製手順を決定し,高純度のタンパク質を得て,その活性も確認した.精製タンパク質の結晶化を試みたところ柱状結晶と板状結晶が得られた.X線回折実験の結果,板状結晶において約2.OÅ分解能のデータを得るころができた.
近年哺乳類で発見された新規DNAグリコシラーゼNeilタンパク質は大腸菌のエンドヌクレアーゼVIIIと高い相同性をもち,塩基除去修復に関与する.マウス由来のNeil1の高発現系を,大腸菌のpETシステムを用いて構築した.C末端側にヒスチジンTagがついている組換えタンパク質を精製し,活性型と不活性型が混在することを避けることを考えて,損傷オリゴDNAを結合させ,その複合体の結晶化スクリーニングを行っている.
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