歯プレセメント質の歯周組織自己再生促進効果を利用した歯周病治療薬の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14208099
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 棟方 正信 北海道大学, 大学院・工学研究科, 教授 (50261326)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 和晃 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (40098017) ; 田島 健次 北海道大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00271643)
• Keywords: 歯プレセメント質 / 細胞走化性因子 / 細胞接着 / サイトカイン / 細胞増殖因子 / 組織再生

Research Abstract

歯周病に罹患し炎症を起こし傷んだ歯肉を手術で切除し,歯根膜や歯槽骨,セメント質といった歯周組織の再生を目的とした組織誘導再生療法が試みられるようになったが,根面に近接する未分化間葉系細胞がセメント芽細胞に分化しないため歯根膜や歯槽骨が完全に再生することができない。筆者らは歯プレセメント質に歯周組織再生能力があることを見い出したので,再生活性物質を単離精製し歯周病治療薬に開発することを目的に研究を行った。抜歯したウシ歯500本から軟組織を除去後,プレセメント質をキュレットを用いて掻爬し,Tris-HCl緩衝液に分散した。ポルテックスミキサーを用いて4℃にて10分間抽出を行った。12000rpm,15分間遠心分離後,上清を限外濾過膜を用いて濃縮し,DEAEイオン交換クロマトグラフィーを行い非吸着画分を得た。吸着画分は,0〜0.5M-NaClグラジエント(Tris-HCl緩衝液)で溶出し,hGF(ヒト歯肉線維芽細胞)に対する走化活性(ボイデンチャンバー法)を指標に測定し,0.25M-NaCl溶出分画に走化活性を認めた。この分画をさらにゲル濾過HPLC,ハイドロキシアパタイトHPLC,逆相HPLCにて単離精製し,SDS-PAGEにて66kDaの単一バンドを示す本研究の目的タンパク質を得て,N末端シーケンスを行った。一方,DEAEイオン交換クロマトグラフィーの非吸着画分にも吸着画分と同程度の走化活性が認められたので,透析後コラーゲナーゼ処理により含有していたコラーゲンを除去し,細胞走化活性を指標に,CMイオン交換クロマトグラフィー吸着,プロテイン-G-HPLC,ゲル濾過HPLC等により単離精製を行い,SDS-PAGEで46kDaを示すタンパク質を得た。N末端シーケンスから新規タンパク質であることを確認した。またチェッカーボード法により細胞移動について検討したところ,濃度勾配に対応して細胞移動が増加したことから走化性物質であることを確認した。