2002 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
14350430
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
上田 宏 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 助教授 (60232758)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 卓也 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)
長棟 輝行 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (20124373)
|
|---|
| Keywords | ファージディスプレイ / 抗体 / 免疫測定 / オープンサンドイッチ法 / ビスフェノールA / ターミネーター / アルカリフォスファターゼ / ビオチン |
|---|
| Research Abstract |
1.繊維状ファージを用いた新規な蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムの確立
ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを構築した.これを抗体の可変領域を構成する二つのドメイン(H鎖可変領域VHおよびL鎖可変領域VL)間の相互作用測定に応用したところ,確かに抗原添加に伴う相互作用変化を測定できた(オープンサンドイッチ法).またファージ産生ホストとしてアンバーサプレッサー変異株を用いることで,二つのドメインVH, VL両者を同時に提示し,可変領域としての抗原結合能を評価することも出来た.しかしながらこれをライブラリからの抗原結合クローンの濃縮に用いた場合,しばしば発現産物の細胞毒性によるとみられる遺伝子の欠落が起こったため,ベクター上にコードされる遺伝子の上流および下流に2個のグルタミンパーメアーゼ由来ターミネーターを挿入したところ,遺伝子の安定性が顕著に改善され抗原によるライブラリ選択が可能になった.
2.SpFvシステムによる,環境ホルモンビスフェノールAの非競争的免疫測定
オープンサンドイッチ法は小分子の非競争的測定が出来るという他にない特徴がある.上記spFvシステムにより,既存の抗ビスフェノールA抗体3種のオープンサンドイッチ法への適性を判定したところ,抗原への親和性の高いクローンほど適性が高いという結果を得た.最適と思われるクローンについて,VHとアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質,およびVLとビオチン化タグとの融合蛋白質を作製してビスフェノールA濃度を測定したところ,競合法より高い感度で非競争的に濃度測定を行うことができた.
|
-
[Publications] T.Yokozeki, H.Ueda, R.Arai, W.Mahoney, T.Nagamune: "A homogeneous noncompetitive immunoassay for the detection of small haptens"Analytical Chemistry. 74・11. 2500-2504 (2002)
-
[Publications] T.Aburatani, H.Ueda, T.Nagamune: "Importance of a CDR H3 basal residue in V_H/V_L interaction of human antibodies"Journal of Biochemistry. 132・5. 775-782 (2002)
-
[Publications] H.Ueda: "Open sandwich immunoassay : a novel immunoassay approach based on the interchain interaction of an antibody variable region"Journal of Bioscience and Bioengineering. 94・6. 614-619 (2002)
-
[Publications] 上田 宏: "化学フロンティア9「コンビナトリアルバイオエンジニアリング」"化学同人. 6 (2003)
