ボツリヌス神経毒素に結合している無毒成分の3次構造と機能の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370093
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 小熊 惠二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (00002262)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西河 淳 東京農工大学, 農学部, 助教授 (30218127) ; 藤永 由佳子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (60252954) ; 横田 憲治 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (00243460)
• Keywords: Botulinum toxin / Neurotoxin / Progenitor toxin / Hemagglutinin / Binding / Receptor / Lactose / Sialic acid

Research Abstract

ボツリヌス毒素の腸管上皮細胞への結合および細胞内での移動を解析するため、まずA〜D型神経毒素、神経毒素と無毒成分の複合体(progenitor toxin)、無毒成分のみ、を簡単に精製する方法を検討した。A型、B型はラクトースゲルカラムを用いたaffinity chromatographyにより、C、D型毒素は従来の方法を多少改善して精製する方法を開発した。次いで各精製タンパク質に対し、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製した後、これらを利用し、A、BおよびC型HA positive progenitor toxinのヒト腸管上皮培養細胞株(T84)への結合性をCell ELISA法により解析した。A〜C型毒素は解離定数(K_D)1×10^<-10>〜5×10^<-10>という高い結合活性を示した。HAはHA1,HA2,HA3a,HA3bの4つのサブコンポーネントから構成されているが、AとC型のそれぞれのサブコンポーネントをGST-fusion蛋白質として発現させて、T84細胞への結合を同様に解析した。GST-type AHA1,-type A HA3b,-type CHA1,-type CHA3bのK_Dは、それぞれ1×10^<-7>〜5×10^<-7>,1×10^<-8>,1×10^<-7>〜5×10^<-7>,1×10^<-8>であったが、GST-HA2とGST-HA3aはA型、C型とも強い結合活性を示さなかった。従って、HAのサブコンポーネントのうちHA1とHA3bに腸管上皮細胞への結合活性があることが明らかになった。一方、マウス結紮腸管ループに蛍光ラベルしたB型HA positive progenitor toxin(16S毒素)を投与し、40分後の毒素の局在をコンフォーカル顕微鏡で観察したところ、腸の吸収上皮細胞のapical側へ一様に強く結合した像、さらには、一部、細胞内への侵入を示唆する像が認められた。

Research Products

• [Publications] Furuse T, et al.: "Passive length-tensile properties of extraocular muscles under botulinum toxin type C"Jpn. J. Ophthalmol.. (in press).
• [Publications] Hughes L, et al.: "Expression of Hc subunit from Clostridium botulinum types C and D their evaluation as candidate vaccine antigens"Infect.Immun. (in press).
• [Publications] Arimitsu H, et al.: "Purification of fully activated Clostridiuim botulinum serotype B toxin for treatment of patients with Dystonia"Infect Immun.. 71. 1599-1603 (2003)
• [Publications] Nazira M, et al.: "Characterization of monoclonal antibodies against haemagglutinin associated with Clostridium botulinum type C neurotoxin"J. Med. Microbiol.. 51. 286-294 (2002)
• [Publications] Sagane Y, et al.: "Spontaneous nicking in the nontoxic-nonhemagglutinin component of the Clostridium botulinum toxin complex"Biochem. Biophysic Res. Communi.. 292. 43-440 (2002)
• [Publications] Nazira M, et al.: "Mucosal immunisation with Clostridium botulinum type C 16S toxioid and its non-toxic component"J.Med.Microbiol.. 51. 813-820 (2002)
• [Publications] 小熊 惠二: "人獣共通感染症 ボツリヌス症"医薬ジャーナル(in press).
• [Publications] 小熊 惠二: "病原菌の今日的意味 ボツリヌス菌"医学ジャーナル社. 289-305 (2003)
• [Publications] 小熊 惠二: "ボツリヌス菌.化学療法の領域"医薬ジャーナル. 323-327 (2002)
• [Publications] 小熊 惠二: "ボツリヌス毒素.化学療法の領域.特集:バイオテロリズム対応策"医学ジャーナル. 347-352 (2002)
• [Publications] 小熊 惠二: "乳児ボツリヌス症"小児科臨床. 1291-1300 (2002)
• [Publications] 小熊 惠二: "細菌毒素ハンドブック 概説III 細菌毒素の応用"サイエンスフォーラム. 17-22 (2002)
• [Publications] 小崎 俊司: "細菌毒素ハンドブック ボツリヌス毒素"サイエンスフォーラム. 86-94 (2002)
• [Publications] 首藤文榮: "細菌毒素ハンドブック C_3酵素"サイエンスフォーラム. 105-112 (2002)
• [Publications] 小熊 惠二: "脳21「特集 2」ボツリヌス療法の現状と将来の展望 ボツリヌス毒素の基礎知識"金芳堂. 53-60 (2002)
• [Publications] 笹川伸之: "特集:新開発の機械・装置II 食品細菌の自動検査装置「バクテクター」の開発"食品工業. 40-49 (2002)