ボツリヌス神経毒素に結合している無毒成分の3次構造と機能の解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370093
• Research Institution: OKAYAMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 小熊 惠二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (00002262)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西河 淳 東京農工大学, 農学部, 助教授 (30218127) ; 藤永 由佳子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (60252954) ; 横田 憲治 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (00243460)
• Keywords: Botulinum toxin / Neurotoxin / Progenitor toxin / Hemaggultinin / Binding / Receptor / Lactose / Sialic acid

Research Abstract

ボツリヌス神経毒素(NTX)、神経毒素-無毒成分の複合体毒素(progenitor toxin, PTX)の腸管上皮細胞からの吸収機構を解明するため、細胞への結合、侵入過程、およびその際に重要な役割を担っているタンパク質の3次構造を解析した。まず、AおよびB型NTX, PTXをラクトースゲルカラムを用いて簡単に精製する方法を開発した(現在、特許を申請中)。次いで、無毒成分の構成成分である赤血球凝集素(HA)の4個の成分(HA-1,-2,-3a,-3b)をGST融合タンパク質として作製し、毒素およびHA各成分の腸管の培養細胞(T84,HT29)への結合性(Kd値の決定など)や、コンフォーカル顕微鏡を用いて細胞内への侵入性を解析した。NTXやHA2,HA3aは結合しない〜低いKd値であったが、HA陽性のPTXおよびHA1,HA3bは高いKd値を示した。さらに、A, B型PTXはHA1を介してガラクトースに、C, D型PTXはHA3bを介してシアル酸に結合することや、結合にはHA1,HA3bのC端側が重要であることが判明した。C型毒素のHT29細胞への侵入性では、NTXは侵入しないが、HA陽性のPTXは4分後には侵入すること,レセプターとしては、糖脂質よりも糖タンパク質上に存在するシアル酸が重要であることが判明した。A, C型HA1の結晶化を試みたところ、C型では成功し、かつ、その3次構造も解明できた;リシンのB鎖と同様に、2個のβ-trefoil構造を示し、糖鎖(特にラクトース)に特異的に結合するドメインを持つ。

Research Products

• [Publications] Fujinaga Y, et al.: "Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal cells and erythrocytes."Microbiol.. (in press).
• [Publications] Arimitsu H, et al.: "Vaccination with recombinant whole heavy chain fragments of Clostridium botulium type C and D neurotoxins."Clin.Diagn.Lab.Immunol.. (in press).
• [Publications] Inoue K, et al.: "Structural analysis by X-ray crystallography and calorimentry of a hemagglutinin component (HA1) of the progenitor toxin from Clostridium botulinum."Microbiol.. 149. 3361-3370 (2003)
• [Publications] Sagane Y, et al.: "Molecular characterization of GroES and GroEL homologues from Clostridium botulium."J.Protein.Chem.. 22. 99-108 (2003)
• [Publications] Woodward LA, et al.: "Expression of Hc subunits from Clostridium botulinum types C and D and their evaluation as candidate vaccine antigens in mice."Infect.Immun.. 71. 2941-2944 (2003)
• [Publications] Arimitsu H, et al.: "Purification of fully activated Clostridium botulinum serotype B toxin for treatment of patients with Dystonia."Infect.Immun.. 71. 1599-1603 (2003)
• [Publications] Furuse T, et al.: "Passive length-tensile properties of extraocular muscles under botulinum toxin type C."Jpn.J.Ophthalmol.. 47. 145-150 (2003)
• [Publications] 小熊 惠二ら: "病原菌の今日的意味(ボツリヌス菌)"医学ジャーナル. 12 (2003)
• [Publications] 小熊惠二ら: "ハリソン内科学(破傷風、ボツリヌス中毒、ガス炭疽など)"メディカル・サイエンス・インターナショナル. 110 (2003)
• [Publications] 小熊惠二ら: "医学大辞典(嫌気性菌(他))"医学書院. (2003)
• [Publications] 小熊惠二ら: "診断と治療(特集) ボツリヌス毒素の構造と標的細胞に対する作用"診断と治療社. 9 (2003)
• [Publications] 小熊惠二ら: "日本医事新報No.4150 ボツリヌス神経毒素の放出機序"日本医事新報社. (2003)
• [Publications] 小熊惠二ら: "日常医療に役立つ小児感染症マニュアル2003-2004(ボツリヌス菌)"東京医学社. 20 (2003)