二酸化窒素様活性窒素種の心血管系組織からの発生機序とその制御に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370120
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 荻野 景規 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (70204104)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神林 康弘 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (20345630) ; 信國 好俊 金沢大学, 医学系研究科, 講師 (80295641) ; 中村 裕之 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (30231476)
• Keywords: ペルオキシダーゼ / ニトロチロシン / 免疫組織 / HPLC / 好酸球 / 心臓 / ヘモグロビン / ミオグロビン

Research Abstract

ラットの全身の主な臓器において、ペルオキシダーゼ活性によりアミノ酸又は蛋白質チロシンをニトロ化する酵素又はヘム蛋白の存在をしらべるために、凍結切片を、H2O2,NO2-を含む緩衝液中で反応させ、NO2-の酸化によるNO2発生に伴う蛋白質のニトロ化を抗ニトロチロシン抗体で免疫染色した。また各臓器のホモジネートを、H2O2、NO2-、アミノ酸チロシン又はウシ血清アルブミンを含む反応液と反応させ、ニトロチロシン抗体を用いた免疫ブロット、HPLCによるニトロチロシンの測定を行った。その結果、ニトロチロシン陽性所見は、肺、脾臓、胃、小腸では好酸球に認められたのに対して、心臓では、心筋細胞内にその局在を認めた。ホモジネートでの検討では、自然沈降分画に好酸球ペルオキシダーゼが存在するのに対して、心臓では可溶性分画に活性蛋白の存在を認めた。
そこで、ラット心臓に存在する、ペルオキシダーゼ活性によりアミノ酸又は蛋白質チロシンをニトロ化する酵素又はヘム蛋白が、どのような生化学的性質を有しているかを検討した。チロシンニトロ化作用を有する蛋白質は、ラット心臓のホモジネートの可溶性分画に存在し、最大活性がpH6.0付近にあった。チロシンニトロ化活性をマーカーとして、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーで精製を進めると、最終的にヘモグロビンとミオグロビンが同定され、さらに別の未知の蛋白の存在が明らかとなった。心臓の凍結切片を用いて、低濃度(5〜10μM)のH2O2、NO2-と反応させ、抗ニトロチロシン抗体で免疫染色すると、心筋細胞内にニトロチロシンの顆粒状の局在が認められた。現在その蛋白の精製分離を行っているところである。

Research Products

• [Publications] Nakamura H, Nagase H, Ogino K, Hatta K, Matsuzaki I: "Uteroplacental circulatory disturbance mediatd by prostaglandin f2alpha in rat exposed to microwaves"Reprod Toxicol. 14. 235-240 (2001)
• [Publications] Ogino K, Kodama N, nakajima M, Yamada A, Nakamura H, Nagase H, Sadamitsu D, Maekawa T: "Catalase catalyzes nitrotyrosine formation from sodium azide and hydrogen peoxide"Free Radic Res. 35. 735-747 (2001)
• [Publications] Nakamura H, Ogawa Y, Nagase H, Nakajima M, Kodama N, Ogino K, Oshita Y: "Natural killer cell activity and its related psychological factor, sense of coherence in male smokers"J Occup Health. 43. 191-198 (2001)
• [Publications] Nakajima M, Takeuchi T, Ogino K, Morimoto K: "Lack of direct involvement of 8-hydroxy-2'-deoxyguanine in hypoxanthine-guannine phosphoribosyltransferase mutagenesis in V79 cells treated with N, N'-bis(2-hydroxypeoxy-2-methoxyethyl)-1,4,5,8-naphthalenetetracarboxylicidimide (NP-III) or riboflavin"Jpn J cancer Res. 93. 247-252 (2002)
• [Publications] Ogino K, Nakajima M, Kubo M, Kimura S, Nagase H, Nakamura H: "Immunohistochemical artifact for nitrotyrosine in eosinophils or eosinophil containing tissue"Free Radic Res. 36. 247-252 (2002)
• [Publications] Kodama N, Kambayashi Y, Kubo M, Kimura S, Nakamura H, Ogino K: "Induction of myeloperoxidase and nitrotyrosine in human eosinophilc leukemia ceil line, Eol-1."Cell Biochme Funct. (in press).
• [Publications] 神林康弘, 荻野景規: "TECHNICAL TERM 消化管"先端医学社. 2 (2002)