2002 Fiscal Year Annual Research Report
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14370796
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
山本 一男 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (70255123)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
児嶋 長次郎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (50333563)
片峰 茂 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (40161062)
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| Keywords | プリオン / 早期診断 / プロテオーム |
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| Research Abstract |
1.目的
プリオン病の早期診断法確立のために、感染から発症に伴うマーカー分子を同定する。
2.方法
正常型プリオン(PrP^C)を大量発現するように操作したマウス神経培養細胞株(N2a58)とそれに変異型プリオン(PrP^<SC>)を感染させた細胞(N2a/Fukuoka-1)を、それぞれサブコンフルエントになるまで培養した後、無血清培地に交換した24時間後の培養上清をTCA沈殿法にて濃縮し、2次元電気泳動を行った。1次元目にpH4-7の等電点ゲル、2次元目に12.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、Sypro Ruby染色した後、画像解析を行った。質量分析用のサンプル調製には、クマシーブル-染色したゲルから目的とするスポットを切り出した。トリプシン消化したペプチド断片をゲルスポットから溶出し、C-18カラムで脱塩・濃縮した後、質量分析計で得られたマスフィンガープリントと合致するタンパク質をデータベースの中から同定した。
3.結果と考察
2次元電気泳動ゲルの比較分析により、分子量60,000前後の領域にpH4-5の範囲に渡って連続したスポットを与えるタンパク質集団、およびpH7付近の分子量14,000のタンパク質がN2a/Fukuoka-1の培養上清で特異的に増大していることが判った。質量分析の結果、これらはいずれも交換前の培地に含まれていたウシ血清タンパク質であることが判明した。血清含有培地から無血清培地への交換は十分に細胞を洗浄してから行っており、かつ別々に調製した複数のサンプルで再現性良くタンパク質スポットの増大が認められたことから、PrP^<SC>の感染によって細胞膜に何らかの変化が起こり、血清タンパク質を保持しやすくなった可能性が考えられる。今後はプリオン感染マウスの血管内皮やリンパ球における膜タンパク質の構成を調べるとともに、血中タンパク質成分の変動を解析していく。
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