分子シャペロンによる蛋白質折れたたみ機構の1分子蛍光イメージング解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380320
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 船津 高志 早稲田大学, 理工学部, 教授 (00190124)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 多田隈 尚史 早稲田大学, 理工学部, 助手 (10339707) ; 田口 英樹 東京工業大学, 資源化学研究所, 助手 (40272710)
• Keywords: シャペロニン / 1分子イメージング / タンパク質間相互作用

Research Abstract

シャペロニンGroELは、ATP加水分解を伴いながらGroESと結合解離を繰り返し、タンパク質の折れたたみを助ける。我々は1分子蛍光イメージング法を用いて、反応サイクルが時定数3秒、5秒の2つの律速過程から構成されていることを示した。また、GroELに結合した酸変性GFPは、GroESが結合した後の3秒間は折れたたみが抑制されていることを示した。以上の結果は、8秒の単一の律速過程しか持たない従来の反応サイクルのモデルでは説明できない。そこで、これまでほとんど行われていなかった変性タンパク質が存在する条件でのGroELのATP加水分解活性を詳細に検討した。我々は、ATP加水分解に伴う3つの反応:(1)リン酸の生成速度、(2)リン酸の放出速度、(3)ADPの放出速度を測定した。手法として、それぞれ(1)マラカイトグリーン法、(2)Pi Binding Protein、(3)NADH酸化反応とカップルさせたADPからのATP再生反応を利用した。その結果、GroESが結合した後、3秒でATP加水分解とPi放出が起こり、さらに5秒を経てADPが放出された。これまで、GroEL-GroES-ADP複合体(cis ADP-complex)は、生理的条件下で1秒以内に解離すると考えられてきた。しかし今回ATP加水分解反応を速度論的に解析することで、時定数5秒の寿命を持った別のGroEL-GroES-ADP複合体(cis ADP*-complex)の存在が明らかになった。

Research Products

• [Publications] Funatsu T., et al.: "Rapid and sensitive detection method of a bacterium using GFP reporter phage"Microbiol Immuno. 46. 365-369 (2002)
• [Publications] Fujiwara I., et al.: "Microscopic analysis of polymerization dynamics with individual actin filaments"Nature Cell Biol.. 4. 666-673 (2002)
• [Publications] Shirasaki Y., et al.: "A novel biomolecule sorter using thermosensitive hydrogel in micro flow system"Micro Total Analysis System 2002. 925-927 (2002)
• [Publications] 船津高志: "1分子蛍光イメージング技術による生命現象の解析"可視化情報学会誌. 22. 18-21 (2002)
• [Publications] 座古保, 船津高志: "生体機能を1分子レベルで探る"分光研究. 51. 3-14 (2002)