4次元結晶構造解析法によるニトリルヒドラターゼの水和反応その場観察

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380321
• Research Institution: RIKEN
• Principal Investigator: 神谷 信夫 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 室長(副主任研究員待遇) (60152865)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾高 雅文 東京農業工業大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20224248) ; 古瀬 宗則 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 協力研究員 (50321807) ; 河野 能顕 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 研究員 (70321750) ; 小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976)
• Keywords: ニトリルヒドラターゼ / 光活性化過程 / 4次元結晶構造解析 / SPring-8 / 大角度回転結晶法 / 部位特異的変異体

Research Abstract

光を受けて活性化し,ニトリルに水を付加する鉄型ニトリルヒドラターゼ(NHase, Rhodococcus sp.N771由来)を材料とし,SPring-8の超高輝度放射光を利用して4次元結晶構造解析を進めた.昨年度に引き続き,鉄型NHaseの光活性化過程を,単一の結晶試料を用いて大きな角度の回転結晶法(LOT)により追跡した.光により鉄から一酸化窒素が解離するとともに新たな水分子が鉄に配位する過程,鉄の配位子場を構成しているシステインスルフェン酸(αCys114-SOH)の酸素原子の極近傍(1.7Å)に新たな水分子が出現する過程を見いだすことに成功した.これらの水分子はNhaseの水付加反応機構に直接関与するものであると予想されるため,4次元データに基づく結晶構造の精密化をさらに進めている.
鉄型NHaseの基質結合キャビティにはαGln92が存在し,反応中心を取り巻く水分子と水素結合している.αGln92をGluまたはAsnに置換した突然変異体を作製して酵素活性を検定したところ,αGln92Gluは野生型の1/4程度の活性を示したが,αGln92Asnでは1/50以下に低下していた.また前者は野生型と同様に安定化剤n-酪酸存在下で安定であったが,後者はn-酪酸と相互作用せず,空気中では数日で活性を失った.これらの結果からαGln92の側鎖は,Nhaseの水付加活性ならびにn-酪酸による安定化に関与することが示唆された.

Research Products

• [Publications] Nakai, T., Ishijima, J., Masui, R., Kuramitsu, S., Kamiya, N.: "Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 H-protein of the glycine cleavage system, resolved by a six-dimensional molecular replacement method"Acta Cryst.Sec.D. 59. 1610-1618 (2003)
• [Publications] Fujihashi, M., Peapus, D.H., Kamiya, N., Nagata, Y., Miki, K.: "Crystal structure of fucose specific lectin from Aleuria aurantia binding ligands at three of its five sugar recognition sites"Biochemistry. 42. 11093-11650 (2003)
• [Publications] Noguchi, T., Nojin, M., Takei., K., Odaka, M., Kamiya, N.: "Protonation Structures of Cys-Sulfinic Acids in the Photosensitive Nitrile Hydratase Revealed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy"Biochemistry. 42. 11642-11650 (2003)
• [Publications] Tsujimura, M., Okada M., Nakayama H., et al.: "A novel inhibitor for Fe-type nitrile hydratase : 2-cyano-2-propyl hydroperoxide"J.Am.Chem.Soc.. 125. 11532-11538 (2003)
• [Publications] Oinuma, K-I., Hashimoto, Y., Konishi, K., Goda, M., Noguchi, T., Higashibata, H., Kobayashi, M.: "Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23 : Sequencing, gene expression, purification and characterization"J.Bio.Chem.. 278. 29600-29608 (2003)
• [Publications] 合田昌彦, 東端啓貴, 橋本義輝, 小林達彦: "新規酵素イソニトリルヒドラターゼの発見"バイオサイエンスとインダストリー. 61. 469-472 (2003)