クランプ-クランプローダー系を介したDNA複製とDNA傷害応答の接点の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380328
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小布施 力史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00273855)
• Keywords: チェックポイント / 蛋白質イメージング / PCNA結合因子 / 質量分析 / 染色体接着 / バキュロウイルス発現系 / DNAヘリカーゼ

Research Abstract

1.チェックポイントクランプ、クランプローダー系の再構築
クランプローダーRFCおよびクランプPCNAに類似した因子が見いだされている。その類似因子の内、チェックポイント応答に関与するRad17,Rad1,Rad9,Hus1のバキュロウイルス発現系を作成し、これらを用いてRad9-Hus1-Rad1からなるクランプおよびRad17-RFC2-5からなるクランプローダー様複合体の再構築を行った。これら2つの複合体は特異的な結合をし、さらに蛋白質イメージングにより、PCNAおよびRFCと相同の構造を持つことを明らかにした。
2.PCNA結合蛋白質の解析
ヒト細胞抽出液のPCNAカラムを用いた分画によりPCNA結合因子を単離し、これらの質量分析による網羅的解析により染色体接着因子Chl12が新規PCNA結合因子として単離されることを明らかにした。
3.染色体接着系のクランプローダーの再構築
上記Chl12をRFCのsmall subunitsと共発現することによりクランプローダー様の複合体になることを明らかにした。さらにPCNAカラムの結果に基づきPCNAとこの複合体が特異的に結合すること、さらに、ATP依存的にPCNAをDNAにロードすることを明らかにした。
4.Werner DNAヘリカーゼ結合蛋白質の発現と機能解析
細胞寿命に関与するWerner DNAヘリカーゼに結合する蛋白質として単離されたWhipという因子もRad17,Chl12同様、RFCに類似のアミノ酸配列を持つ。この因子もRFC small subunitsと複合体になってクランプローダー様の複合体になる可能性を検討した。その結果、Whipはクランプローダー様複合体とならずそれ自身の6〜8量体複合体を形成し、ATPase活性を有することを明らかにした。

Research Products

• [Publications] S.Ohta: "A proteomics approach to identify PCNA binding proteins in human cell lysates : identification of the human CHL12/RFCs2-5 complex as a novel PCNA binding protein"J. Biol. Chem.. 277. 40362-40367 (2002)
• [Publications] T.Iida: "PCNA clamp facilitates action of DNA cytosine methyltransferase 1 on hemimetylated DNA"Genes Cells. 7. 997-1007 (2002)
• [Publications] Y.Shiomi: "Clamp and clamp loader structures of human checkpoint protein complexes, Rad9-1-1 and Rad17-RFC"Genes Cells. 7. 861-868 (2002)
• [Publications] R.Tadokoro: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S.cerevisiae during the cell cycle."J. Biol. Chem.. 277. 15881-15889 (2002)
• [Publications] 釣本敏樹: "松影昭夫・正井久雄編、「ゲノムの複製とその制御」シュプリンガー・フェラーク東京"クランプとクランプローダー. 10 (2002)