網膜双極細胞終末部の形質膜近傍におけるシナプス小胞とCaイオンの動態解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380375
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 立花 政夫 東京大学, 大学院・人文社会系研究科, 教授 (60132734)
• Keywords: 網膜 / シナプス / Caイオン / 開口放出 / 双極細胞 / シナプス小胞 / Ca電流 / 伝達物質

Research Abstract

本研究は、近接場光顕微鏡を用いて膜近傍(150nm以下)における蛍光プローブの強度変化を高速イメージングすることによって、神経終末部でのCaチャネルの活性化に伴う細胞内Caイオンの動態とシナプス小胞の動態を明らかにすることを目的としている。
実験には、キンギョ網膜から単離したオン型双極細胞を用いた。蛍光性Ca指示薬Fluo-4FFを記録用パッチ電極から双極細胞の軸索終末部に導入し、膜電位固定下で脱分極パルスを与えたときの蛍光強度の変化を近接場光顕微鏡で計測すると共に、Ca電流及び開口放出に伴う微小膜容量変化を記録した。観察された複数のCaドメインの時空間変化をミリ秒オーダーで解析した結果、各Caドメインの中心部と約500ミクロン離れた周辺部でのCaイオン濃度上昇の時間遅れは、微小膜容量変化の測定から推定された早い開口放出と遅い開口放出の時間遅れの半分以下であった。時間遅れの不一致の原因として、Ca測光系のアーティファクトである可能性や、Caドメインの中心部と周辺部で開口放出に関与するCaセンサーの感受性が異なる可能性等が示唆された。
細胞外からFM1-43をシナプス小胞に取り込ませ、近接場光で励起された蛍光像(輝点)を計測した。双極細胞に脱分極パルスを与える前後で輝点がどのように変化するかを解析した結果、シナプス小胞が細胞膜に融合(開口放出)したのか、あるいは、細胞膜から単に遠ざかったのかを区別することができた。