液胞型V-ATPaseサブユニットアイソフォームの生理的意義

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14540600
• Research Institution: Okayama Prefectural University
• Principal Investigator: 池田 己喜子 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (20112154)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 恵 岡山県立大学, 保健福祉学部, 助手 (80254564)
• Keywords: V-ATPase / サブユニットアイソフォーム / 発現 / 酵母 / 機能 / ペプチド抗体 / カサノリ

Research Abstract

I.単細胞緑藻カサノリのV-ATPaseサブユニットアイソフォームの酵母での発現及び機能解析
液胞型のプロトンポンプであるV-ATPaseのproteolipid subunit(プロトン輸送路を形成)について、カサノリの場合、6種類の遺伝子(Vc1〜Vc6)をクローニングした。これら6種類のアイソフォームの機能について酵母発現系を用いて解析を行った。その結果を以下にまとめる。
1)Vc1〜6は、一次構造からは二つのグループに分類される(Vc1&3及びVc2,4,5,6)。恒常的に発現するプロモーターを持つ酵母発現ベクターに組み込み、酵母VMA3欠損株に導入し、形質転換体の液胞の酸性化の回復を蛍光顕微鏡により観察した。Vc1&3は液胞の酸性化を回復しないこと、一方、Vc2,4,5,6は機能を回復できることをみいだした。即ち、Vc2,4,5,6は酵母V-ATPase,proteolipid subunitの一つであるVma3pとして機能することを明らかにした。
2)同様の発現を、誘導可能なプロモーターを持つ酵母発現ベクターを用いて行った。1)では機能回復できなかったVc1 & 3も、大量に発現させれば、液胞の酸性化を回復することをみいだした。
3)更に、酵母V-ATPase, proteolipid subunit (c')をコードするVMA11欠損株を作成し、二つのグループの代表としてVc1&3及びVc2&5の1)と同様の発現、蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、液胞の酸性化はほとんど観察されなかった。誘導をかけて、大量発現させた場合にも有意な酸性化はみられなかった。
以上の結果から、Vc1-Vc6の6種類のアイソフォームはVma3pとしてV-ATPase complexのVO subcomplexに組み込まれ機能すること、Vma11pとしては機能できないことが明らかになった。
II.単細胞緑藻カサノリのV-ATPaseサブユニットアイソフォームに特異的なペプチド抗体の作製
Vc:MADEIYGPVQLT,Vc2:TATPTTPGTEAS,Vc3:MADETKGPVQLT,Vc4:MAETPTTPTSDTTT,Vc5:MATAETPSATPAA、Vc6:MSATPSETLS,それぞれのアイソフォームのN末端近辺のオリゴペプチドを委託合成し、各ペプチドにつきそれぞれ家兎2羽に免疫、ポリクローナル抗体を委託作製した。アミノ酸配列からVc1とVc3、Vc2とVc4に対する抗体の間に交差反応の可能性が予測されたが、Western blotによる解析の結果、それぞれ特異的にアイソフォームを認識することを明らかにした。
これらの抗体は、Western blotによるカサノリの成長段階とアイソフォームの発現、更に、免疫組織染色により細胞内局在性にアプローチするためのツールとして期待できる。今後、その方向で研究を進めていく。

Research Products

• [Publications] Ikeda, M., Umami, K., Kurisu, N., Nakanishi, Y., Maeshima, M.: "The VHA-c isoforms of Acetabularia acetabulum function as Vma3p but not as Vma11p, by heterologous expression in yeast"Eur.J.Biochem.. (in press). (2004)
• [Publications] 中西洋一, 池田己喜子, 前島正義: "「植物の膜輸送システム:ポンプ・トランスポーター・チャネル研究の新展開」第1章 無機イオン(栄養塩)の輸送 2.液胞型プロトンポンプの構造と細胞機能"加藤 潔、島崎研一郎、前島正義、三村徹郎 監修. 6/240 (2003)