イネグルテリンとプロラミンの分別集積に対するプロテインジスルフィドイソメラーゼの機能の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14560077
• Research Institution: Yamaguchi Prefectural University
• Principal Investigator: 小川 雅広 山口県立大学, 生活科学部, 教授 (10160772)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 熊丸 敏博 九州大学, 農学部, 助教授 (00284555)
• Keywords: イネ / 突然変異体 / 金南風 / esp2 / ジルフィド結合 / プロテインジスフィドイソメラーゼ / PDI / 分子シャペロン

Research Abstract

(1)60kDaPDIの全長DNAの解析:(1)原品種「金南風」の胚乳のcDNAライブラリーから60kDaPDIの全長基配列を決定した。その結果、アミノ酸残基数は511であった.C末端側に小胞体局在シグナルKDEL配列を有し、小胞体局在タンパク質であることが明らかになった。(2)イネ60kDaPDIの全配列を用いてトウモロコシ、オオムギ、コムギの塩基配列の相同性を調べたところ約86%の相同性があった。従ってイネ胚乳のPDIはイネ科種子のPDIと構造が極めて類似していることが明らかになった。
(2)40kDaPDIと60kDaPDIの構造上の特性の解明:新たに見い出された40kDaPDIの全塩基列と全長の60kDaPDIとのホモロジーは35%と低いことが明らかになつた。PDI特有のCXXC配列が40kDaPDIでは59残基目で、一方60kDaPDIではN末端側から68残基目にあった。そして2ケ所目が40kDaPDIでは195残基目で、60KDaPDIでは413残基目にあることが判明した。C末端は40KDaPDIではNDEL配列、一方60kDaPDIではKDEL配列と配列が異なることから起源タンパク質が異なるのではないかと考えられた。
(3)40kDaPDIと60kDaPDIのイネ組織間における発現の特異性の解明:原品種「金南風」と突然変異体esp-2の各組織、葉、根、種子及びカルスにおける両PDI遺伝子の発現様式の差異をノーザンプロツト解析を用いて調査したが、種子以外でははっきりとした結果は得られなかった。従って来年度この研究をさらに実施することにした。
(4)イネ植物体における2種類のPDIの酵素活性測定法を確立した。それぞれのPDIに特異的な抗体を用いるため両遺伝子のDNAをE.coliに組み込み、それぞれの蛋白質を大量発現させ、蛋白質の精製を行い、それぞれに特異的な抗体の作成を行った60kDaPDIの抗体は特異性が低かったために完全長DNAを用いて再度タンパク質を得、抗体の作成をすることにした.また、40kDaPDIの抗体はPDI活性を阻害することが分かった。
(5)60kDaまたは40kDaPDIのアンチセンス遺伝子組み換え体イネの作出
部分長の60kDaPDIのDNAのDNAのアンチセンス遺伝子組み換え体の作出を行った。組み換え体は順調に生育しており、登熱種子の固定包埋を実施している。結果は来年度になる見込みである。

Research Products

• [Publications] Takemoto, Y. et ad.: "The Rice Mutant esp2 Greatly Accumulates the Glutelin Precursor And Deletes the Protein Disulflde Isomerase"Plant Physiology. 128. 1212-1222 (2002)
• [Publications] Qu, L.Q.et al.: "Inheritance of Alles for Glutelin a-2 Subunit Genes in Rice And Identification of Their Corresponding cDNA Clone"Theor. Appl. Genet.. 105. 1099-1108 (2002)