2002 Fiscal Year Annual Research Report
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14560286
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
宇井 定春 山梨大学, 工学部, 助教授 (80115310)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
楠木 正巳 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教授 (90135749)
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| Keywords | 2,3-butanediol / acetoin / 2,3-butanediol dehydrogenase / stereospecificity / chiral / shrt chain dehydrogenase / reductase family / X-ray crystallography / protein engineering |
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| Research Abstract |
目的:
2,3-Butanediol dehydrogenase(BDH)はacetoin(AC)と2,3-butanediol(BD)間の酸化還元反応を触媒する酵素であるが、種々の立体基質特異性を持つものが存在する。特に、Klebsiella pneumoniae由来のR, S-BDH(R-AC forming)とBrevibacterium saccharolyticum由来S, S-BDH(S-AC forming)は各々その厳格な基質特異性を持つにも関わらず、アミノ酸配列のホモロジーが高く、双方ともSDR familyに属すことが知られる。また、進化系統樹においても極めて類縁性が高い。以上の知見から、両酵素のキラル認識機構の相違とその獲得には非常に興味が持たれた。
結果:
先にこれらの解明のために両酵素のX線結晶構造解析を行った。この結果、両酵素は立体構造においても極めて類縁性が高いことが明らかとなった。そこで、得られた立体構造の知見を基に、互いのアミノ酸側鎖を入れ換えたキメラBDH及び認識機構解明のためのポイントミュータントBDHを作成した。以上の結果、基質認識と立体構造の関係が明確となり、更にその結晶構造解析を行うことにより、基質認識機構を解明することに成功した。また、その基質認識に関係する最小アミノ酸ユニットが確定されたことから、新たなミューテーションを行うことにより、両酵素の立体基質特異性の相互変換に成功した。更に、酵素安定性に関する構造的知見の獲得にも成功した。
以上の知見を基に元来酵素安定性の低い上記のS, S-BDH(S-AC forming)に代え、安定性の高いS, S-BDH(S-AC forming)を新たに開発した、また、これを利用することによりS, S-BDの効率的な調製方法を確立した。
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